电穿孔介导的 体外 基因递送：一种通过电脉冲技术将编码荧光报告蛋白的质粒导入培养细胞的方法

摘要

来源：Lo, J. C. W. 等，一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路 J. Vis. Exp. （2021）

本视频展示了电穿孔技术，该技术将编码荧光蛋白的质粒DNA导入小鼠原代小脑颗粒细胞前体中。

方案

1. 用于Hh受体转基因过表达的电穿孔：  pEGFP-Smo

1. 使用2 mm间隙电穿孔杯进行电穿孔时，为每次电穿孔反应配制以下质粒-细胞电穿孔混合液：1.2 × 10⁶ 个小鼠原代小脑颗粒细胞前体细胞和10 µg的pEGFP-mSmo（将DNA储备液浓度调整为Tris-EDTA缓冲液或无菌dH₂O中的~2–5 µg/µL），溶于100 µL Opti-MEM中。 
   注意：若细胞数量不足，可减少总细胞数（但可能降低电穿孔效率）。然而，不得调整质粒用量或每只电穿孔杯所用Opti-MEM的总体积。若实验所需总细胞数超过1.5 × 10⁶ 个细胞，应相应扩大电穿孔混合物体积，并分别进行多次电穿孔反应。电穿孔杯最多可重复使用5次。
2. 通过向含有包被盖玻片的24孔培养板每孔加入0.5 mL培养基，预先准备好电穿孔后细胞接种板，并在CO₂ 培养箱中37 °C保温。为准备用于细胞贴附的盖玻片，将经高压灭菌的12 mm玻璃盖玻片与100 µg/mL的多聚-D-赖氨酸（PDL，溶于无菌dH₂O的1 mg/mL溶液）在37 °C孵育至少1小时。使用前将盖玻片保留在相同的PDL溶液中，置于4 °C保存。
3. 将所需数量的细胞用移液器转移至无菌1.5 mL微量离心管中，在室温下以200 × g 离心5分钟。弃去上清液，并用200 µL Opti-MEM重悬细胞沉淀。用Opti-MEM重复此步骤两次，以确保管内无残留培养基。
   注意：对于24孔板的每一孔/盖玻片，应电穿孔并接种1.2–1.3 × 10⁶ 个细胞/孔，以在培养次日获得约70–75%的细胞汇合度。
4. 将电穿孔参数设置为 表1所示。
5. 轻轻吹打电穿孔反应液使其充分混匀，并使用长型P200枪头将恰好100 µL混合液转移至2 mm间隙电穿孔杯中。避免产生气泡。
6. 将电穿孔杯放入电穿孔杯室中。
7. 按下电穿孔仪上的Ω按钮（参见 材料表），记录阻抗值，该值应为~30–35。为确保电阻抗值Ω处于30–35范围内，必须精确加入100 µL体积。
8. 按下 启动 按钮以启动脉冲。
9. 记录读数框中显示的实测电流和焦耳值。
10. 从电穿孔杯室中取出电穿孔杯。
11. 立即向电穿孔杯中加入100 µL预温的培养基，并通过轻柔吹打2–3次重悬细胞。立即将细胞悬液转移至步骤1.2中准备好的含包被盖玻片的24孔板中。
    注意：为最大限度减少细胞死亡，应在电穿孔后立即接种细胞。
12. 将细胞在37 °C、CO₂ 培养箱中培养。静置培养3小时，避免扰动，以防细胞脱落。
13. 接种后3小时，轻柔吸除并弃去一半上清液以去除漂浮的死细胞和碎片，并加入等量预温的培养基进行替换。
14. 将细胞在37 °C 、CO₂ 培养箱中继续培养。

	穿孔脉冲设置		转移脉冲设置
	小鼠原代颗粒细胞前体	原代神经元	小鼠原代颗粒细胞前体	原代神经元
电压	275 V	275 V	20 V	20 V
时长	1 ms	0.5 ms	50 ms	50 ms
间隔	50 ms	50 ms	50 ms	50 ms
次数	2	2	5	5
D速率	10%	10%	40%	40%
极性	+	+	±	±

表1： 使用Super Electroporator NEPA21 TYPE对小鼠原代颗粒细胞前体（GCPs）和原代神经元进行电穿孔的参数

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27 添加剂	Life Technologies LTD	17504044
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-谷氨酰胺替代物
Matrigel	BD Biosciences	354277	基底膜基质
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407
CU 500 电穿孔比色皿室	Nepagene	CU500
EPA 电穿孔比色皿（2 mm 间隙）	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	用于转染的低血清培养基
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II 体外与体内电穿孔系统	Nepagene	NEPA21	电穿孔仪