寄生虫形态的核转染：一种基于电穿孔的转染方法将编码荧光蛋白的质粒导入子孢子细胞核

摘要

来源：Duan, C. 等 核转染与鸡体内扩增 艾美球虫属 寄生虫。 视频实验杂志 (2020)

在本视频中，我们介绍了核转染技术，这是一种基于电穿孔的转染方法，用于将编码荧光报告蛋白的质粒DNA导入鸡艾美球虫（Eimeria）的子孢子阶段寄生虫中。

方案

1. 裂殖子或子孢子的核转染

1. 转染前的寄生虫准备
   1. 在一支离心管中准备约 10⁷ 个裂殖子或子孢子。若转染裂殖子，需准备 3–4 支离心管。
   2. 准备不少于 10 µg 的质粒 DNA 或纯化的 PCR 片段。
      注意：本研究中使用的质粒包含两个基因：增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和来源于 Toxoplasma gondii 的二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（TgDHFR-TS）。
   3. 准备 25 U 限制性内切酶。若质粒为线性化形式，加入限制性内切酶可提高转染效率；若质粒为环状，则省略限制性内切酶。
   4. 准备 85 µL 核转染缓冲液（表 1）：将 20 µL 核转染缓冲液 I 与 1 mL 核转染缓冲液 II 混合，并取其中一部分使用。总体积为 100 µL。
2. 核转染
   1. 将子孢子或裂殖子悬液在 600 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
   2. 按以下顺序向含有子孢子或裂殖子的 1.5 mL 离心管中加入 85 µL 核转染缓冲液、10 µg 质粒（或 PCR 片段）以及 25 U 限制性内切酶（通常为 5 µL）。
   3. 将悬液转移至核转染杯中，并将转染杯放入核转染仪的转染槽内。
   4. 按下电源按钮启动核转染仪，选择转染程序 U-033。若仪器启动后进入“自由程序选择”模式，请按 X 按钮退出该模式。
   5. 程序完成后，按下核转染仪的 X 按钮，屏幕应显示“OK”，表明核转染成功。
   6. 向核转染杯中加入 0.5–1 mL 改良杜尔贝科氏伊格尔培养基（DMEM）以终止反应，轻轻混匀后将悬液转移至 1.5 mL 离心管中。

缓冲液	成分
Nucleofection buffer I	ATP二钠盐 2g，MgCl2-6H2O 1.2g，水 10 ml
Nucleofection buffer II	KH2PO4 6 g，NaHCO3 0.6 g，葡萄糖 0.2 g，水 500 ml
*水：蒸馏水

表1：缓冲液的组成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	MACGENE	CM15019
核转染仪	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
葡萄糖	Sigma	编号 V900116
ATP二钠盐	Sigma	A26209
纤维素DE-52	Solarbio	C8350
KH2PO4	Sigma	编号 V900041
低速离心机	北京时代北利离心机有限公司	DT5-2
MgCl2	Sigma	449164
NaHCO3	Sigma	144-55-8
PBS	Solarbio	P1010
Sorvall Legend Micro 17 微型离心机	ThermoFisher Scientific	75002430
胰蛋白酶	Solarbio	T8150
Percoll（密度梯度储备液）	GE Healthcare	17-0891-09