基于慢病毒载体的卵周隙注射：一种将目的基因导入受精单细胞小鼠卵母细胞的方法

摘要

来源：Dussaud, S. 等，慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究创始鼠的简单高效方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了将慢病毒载体注射到受精小鼠胚胎的卵周隙中的原核显微注射技术。该慢病毒含有转基因，可整合到受精胚胎的基因组中，最终产生转基因小鼠。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从受精卵中去除卵丘细胞。

1. 在体视显微镜下，使用两支胰岛素注射器：第一支用于固定输卵管，第二支用于撕开壶腹部并将受精卵分散至透明质酸酶工作液中。
2. 取已准备好的玻璃移卵管，连接导管和安装在吹嘴上的0.22 μm滤器，吸取全部卵子。收集所有卵子，并通过连续移入6个不同的100 µL M2培养基液滴中进行洗涤。
3. 将洗涤后的受精卵置于含5% CO₂的湿润化37 °C培养箱中，孵育于M16培养基内。

2. 制备注射移液管

1. 使用壁薄的玻璃毛细管（长度10-15 cm），外径为1 mm，将该毛细管夹入水平显微注射拉制仪中。
   注意： 在大多数水平拉制仪中，可调节三个参数：加热功率、拉力强度以及加热与拉制之间的时间延迟。调节这些参数以获得与图1A所示相似的注射用移液尖端。对于常规进行DNA显微注射的操作者，可采用标准设置，并通过调整加热与拉制之间的时间延迟来改变移液尖端的整体形状。

3. 制备持卵管

1. 使用注射移液管制备持卵移液管。
2. 将注射移液管连接至显微拉针仪。用显微拉针仪切割移液管，获得直径为 80 至 100 µm 的尖锐对称尖端。随后在显微拉针仪上用热处理抛光尖端，使其形成无锐利边缘的对称圆形结构。

4. 含慢病毒载体的注射移液管的制备

1. 将慢病毒载体悬液在160 × g条件下离心2分钟，以沉淀通常存在于冷冻慢病毒储备液中的碎片。
2. 收集上清液，并在II级生物安全柜中转移至新的0.5 mL离心管中。
3. 使用Micro-loader将1 µL上清液转移至按步骤5所述准备的注射移液管中。
4. 将注射移液管安装到右侧显微操作仪的仪器支架上。将持卵移液管连接至左侧显微操作仪。
   注意：慢病毒载体的转导滴度将直接与 founder 动物制备效率相关。为获得高效率（>70%），应使用p24衣壳蛋白含量在100 ng/µL左右的病毒载体。当滴度以转导单位（TU）表示时，滴度应高于10⁹ TU/mL。慢病毒载体储备液必须通过在293T细胞中瞬时转染p8.91包装质粒和编码水疱性口炎病毒（VSV）糖蛋白G的pHCMV-G质粒来制备，具体方法见补充方法部分。

5. 显微注射

1. 在凹面载玻片中央加入 8 µL M2 培养基，并覆盖轻质石蜡油（经胚胎检测），以防止蒸发。
2. 将 20 个卵尽可能分散地放入液滴中。
   注意：放置胚胎时避免产生气泡。
3. 确保注射毛细管尖端畅通。若堵塞，可用持卵毛细管轻敲注射毛细管以疏通。
4. 将显微注射仪设置为注射时间为 20 秒。
   注意：病毒悬液的黏度可使病毒载体在卵周隙中的扩散情况清晰可见。注射压力应调整至在 20 秒内充满整个卵周隙，相当于注射体积为 10 至 100 pL。注射压力不得超过 600 hPa。
5. 在体视显微镜下，用持卵毛细管吸取一个含有两个原核和两个极体的受精卵。
6. 使用显微注射仪将受精卵的卵周隙进行注射。
   注意：注射毛细管不得接触细胞质膜。
7. 将所有可用的受精卵以每批 20 个进行注射，并立即将注射后的卵移入预热的 M16 培养基中，置于含 5% CO₂ 的湿润化 37 °C 培养箱中培养。
   注意：注射后需至少培养 30 分钟，方可进行胚胎移植。

结果

图1：显微注射移液管的制备与基因分型。
(A) 显微注射移液管的示意图，用于突出用于DNA或慢病毒载体注射的移液管之间的主要差异。左图：绘制了两种类型移液管的整体形状。虚线圆圈标示了移液管尖端的放大区域，并展示了移液管尖端的实际图像。请注意，用于慢病毒注射的移液管尖端需按虚线所示进行断裂，右侧图片即为相应示例。右图：卵母细胞注射设置示例，左侧为持卵管，中间为受精卵，注射移液管插入其中一个原核或卵周隙中。比例尺 = 50 µm。(B) 对从8个不同胚胎（泳道1至8）提取的基因组DNA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰岛素注射器  	VWR	 613-3867	Terumo Myjector
校准微量毛细移液管用吸管管组件  	Sigma	A5177-5EA
透明质酸酶 30mg  	Sigma	H4272 	经小鼠胚胎测试
硼硅酸盐玻璃毛细管  	Harvard apparatus	GC 100-10
倒置显微镜	 Nikon	  Transferman NK2 5188	需配备霍夫曼调制对比照明装置
显微操作仪 	Eppendorf 	Celltram air