激光辅助慢病毒基因递送：一种用于增加小鼠受精卵通透性以促进慢病毒基因递送的技术

摘要

来源：Martin, N. P., 等. 激光辅助慢病毒基因递送至小鼠受精卵。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们演示了利用激光辅助穿透小鼠受精卵透明带保护层的技术，以促进慢病毒介导的基因递送。慢病毒能够将目的基因稳定整合到基因组中，从而生成转基因动物。

方案

1. 使用 XYClone 激光穿孔小鼠受精卵

1. 根据制造商的建议安装并校准 XYClone 激光系统。其他通常用于 体外 受精，可用以替代XYClone激光对受精卵进行穿孔。
   1. 将激光控制器盒的导线连接到显微镜的激光装置上。
   2. 通过 USB 端口将激光控制器盒连接到运行激光软件的计算机。3.1.3. 接通激光控制器电源并打开开关。
   3. 通过目镜观察，对测试样本进行穿孔（例如玻璃载片上的白板笔标记）。
   4. 使用激光套件中附带的小螺丝刀，调节激光的X轴和Y轴位置，使其与通过显微镜目镜可见的LED光源重合，从而校准激光。
2. 将含有小鼠受精卵的KSOM液滴培养皿置于显微镜载物台上。培养皿在培养箱外放置时间不得超过15分钟。
3. 通过显微镜目镜观察，确保胚胎的透明带处于焦点位置，并且激光LED光源可见。
4. 移动显微镜载物台，使 LED 光源/激光对准透明带。
5. 使用计算机软件将XYClone激光器设置为250 μs。
6. 将LED光源大小调整至所需尺寸（本实验中设为5档）。
7. 用激光对每个受精卵的透明带进行三次穿孔。透明带可被完全穿透或部分削薄。采用上述设置时，激光将产生直径为10 μm的孔洞。图1).
   注意： 将激光对准靠近极体的位置，可使激光远离胚胎细胞。
8. 让受精卵在组织培养孵育箱中恢复2小时，然后再进行下一步操作。

2. 小鼠受精卵经XYClone激光穿孔后的转导

1. 将2 μL浓缩的慢病毒（滴度大于1e8 TU/mL）加入50 μL KSOM液滴中。不要反复吹打。受精卵容易黏附在移液枪头末端。根据我们的经验，在小于3 μL的体积中加入1e5–5e5转导单位的慢病毒，是基因递送的最佳条件。
2. 将受精卵在培养箱中继续培养4天，使其发育至囊胚阶段。无需更换培养基。

3. 转导小鼠胚胎向假孕小鼠的非手术移植

1. 使用交配后3.5天的假孕小鼠。
2. 使用非手术胚胎移植（NSET）装置将小鼠胚胎植入假孕小鼠体内。
   1. 在手术显微镜或解剖显微镜下，插入阴道扩张器以观察宫颈。
   2. 将非手术胚胎移植（NSET）装置插入宫颈约5 mm，并在约2 μL的体积中释放胚胎。
      注意：每次移植均需使用无菌的NSET装置，操作完成后即丢弃。操作胚胎所用的所有试剂必须无菌。
3. 将10–15个健康的囊胚以2 μL KSOM液滴体积移植至每只假孕小鼠体内。
4. 在随后的几天内持续监测并测量假孕小鼠的体重增长，以判断NSET是否成功。
5. 通过让怀孕小鼠自然分娩，或在胚胎移植后17天进行剖腹产来获得仔鼠。若胚胎数量极少且发育过大导致无法自然分娩时，通常需要进行剖宫产。
6. 采集仔鼠组织进行基因型鉴定，以确定转基因效率。

结果

图1： 小鼠受精卵的激光处理。透明带打孔与透明带变薄的示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD510B-1 质粒	System Biosciences	CD510B-1	用于包装表达 EF1a-copGFP 的慢病毒
二甲基聚硅氧烷	Sigma	DMPS5X	胚胎培养
XYClone 激光系统	Hamilton Thorne Biosciences		穿孔处理小鼠受精卵
非手术胚胎移植（NSET）装置	ParaTechs	60010	胚胎的 NSET 操作
<strong>KSOM 培养基</strong>	Millipore	MR-020P-5F	胚胎培养
<strong>KSOM 的组成：</strong>			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4&nbsp;7H2O			4.95
CaCl2&nbsp;2H2O			25
NaHCO3			210
葡萄糖			3.6
Na-丙酮酸盐			2.2
DL-乳酸钠盐			0.174mL
10 mM EDTA			100&micro;L
链霉素			5
青霉素			6.3
0.5% 酚红			0.1mL
L-谷氨酰胺			14.6
MEM 必需氨基酸			1mL
MEM 非必需氨基酸			0.5mL
BSA			100