基因枪介导的基因转移：一种通过基因枪将目的基因递送至靶细胞的技术

摘要

来源：Taylor, T., 等 通过基因枪法将荧光标记基因导入机会性真菌病原体Cryptococcus neoformans。 J. Vis. Exp. (2015)。

在本视频中，我们演示了通过基因枪介导的生物弹道法将基因递送至培养细胞的实验方案。该方法仅需少量DNA即可实现稳定的遗传转化，操作简便。

方案

1. DNA 的制备

1. 使用镊子将橙色宏载体基因枪圆片浸入100%乙醇中，以制备圆片。将圆片放入含有干燥剂的大培养皿中干燥（确保干燥剂不接触圆片）。
2. 待圆片干燥后，将其压入银质圆片支架中（支架需预先用100%乙醇擦拭处理）。
3. 将悬浮于100%乙醇中的金微载体珠充分涡旋振荡，并每管分装12 µl至1.5 ml微量离心管中，每项转化使用一管。
4. 按顺序向每管中加入：2 µg DNA（建议加入2 µl浓度为1 µg/µl的DNA）、10 μl 2.5 M CaCl₂ 和 2 μl 1 M亚精胺游离碱。
5. 设置阴性对照，操作同步骤1.4，但不加入DNA。
6. 将各管涡旋振荡，室温孵育5分钟。孵育期间可轻轻弹动各管，以重新悬浮沉降的微珠。
7. 以225 × g离心30秒，使DNA包被的金微珠形成沉淀。小心吸除上清液（使用移液器或抽吸法），并弃去。
8. 用移液器缓慢吹打，将微珠完全重悬于600 µl 100%乙醇中。
9. 以225 × g离心30秒，使微珠沉淀但不压紧。小心吸除并弃去上清液。
10. 用移液器缓慢吹打，将DNA包被的金微珠重悬于8 µl 100%乙醇中。
11. 将DNA包被的金微珠溶液移至基因枪圆片中心，形成直径约1 cm的液滴，并使其自然干燥。
    注意：若在基因枪圆片中心可见干燥的金色环状物，表明金微珠浓度足够。
    注意：装载了DNA包被金微珠的宏载体圆片现已可直接用于基因枪操作。

2. 基因枪的操作

1. 打开真空泵。
2. 逆时针旋转旋钮，打开氦气，直至压力表显示压力约为 2,200 psi。
3. 向左拨动红色开关，打开基因枪。
4. 确保调节真空和放气的流速，使真空度在 15 秒内达到 28 英寸汞柱（Hg）。
5. 确保破裂盘与宏载体之间的距离约为 3/8 英寸。
6. 用乙醇擦拭整个腔室，进行清洁。
7. 将破裂盘浸入 100% 乙醇中，然后在无菌表面（e.g.，培养皿）上晾干。
8. 使用扭矩扳手松开破裂盘固定器。将一片洁净的破裂盘插入固定器中，再将固定器旋回原位，并用扭矩扳手向右旋转一圈拧紧。
   注意：每次射击后需更换破裂盘。
9. 将金属网筛浸入 100% 乙醇中，然后在无菌表面（e.g.，培养皿）上晾干。
10. 晾干后，将清洗过的金属网筛放置在白色塑料安装板上。将带有 DNA 的宏载体盘固定器（DNA 面朝下）放入盘腔中。拧上银色盖帽，并将安装板置于最高位置的槽中。 
    注意：每次射击后需更换金属网筛。
11. 将含有 1 M 山梨醇的 YPD 琼脂平板放置在底部托板上。
12. 关闭腔室门并锁紧。
13. 向上推动并按住中间的红色开关，启动真空泵，使真空度达到 28 英寸汞柱（Hg）。达到所需真空度后，将该开关拨回至向下位置。准备就绪后，按住右侧红色开关进行射击。当破裂盘爆裂时，立即松开射击按钮，并将中间红色开关推至中间位置，使腔室排气至 0 psi。
14. 清除破裂盘残渣并关闭基因枪。然后顺时针旋转旋钮关闭氦气，最后关闭真空泵。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.6 μm 金微粒	Bio-Rad	165-2262	http://www.bio-rad.com
无精胺游离碱	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350 psi 破裂盘	Bio-Rad	165-2330	http://www.bio-rad.com
阻停筛网	Bio-Rad	165-2336	http://www.bio-rad.com
宏载体圆盘	Bio-Rad	165-2335	http://www.bio-rad.com
PDS-1000/He 系统	Bio-Rad	165-2257	http://www.bio-rad.com
Microfuge 18 离心机	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com