基于磁转染的体外转染：一种利用磁性纳米颗粒在磁场辅助下将质粒递送至原代小鼠神经元细胞的技术

摘要

来源：Jacquier, A. 等 模拟夏科-马里-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元 J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们展示了在原代神经元细胞培养中进行磁引导转染质粒DNA的方法。磁转染技术利用外部磁场，将结合在磁性纳米颗粒上的质粒引导至细胞质中。

方案

1. 多聚鸟氨酸/层粘连蛋白（Po/L）培养皿包被

注意：体积量已调整为适用于包被24孔板。

1. 如有需要，将无菌的12 mm盖玻片放入孔中。
2. 用500 µL溶于水的10 µg/mL多聚-L-鸟氨酸溶液包被各孔。
3. 室温静置1小时。
4. 吸除多聚-L-鸟氨酸溶液，室温晾干30分钟。
5. 加入500 µL含3 µg/mL层粘连蛋白的碳酸氢盐L-15培养基，37 °C孵育过夜。
   注意：包被后的孔可在37 °C培养箱中保存7天。对于长时间孵育，可在孔之间加入无菌PBS，以减少培养基蒸发。

2. 运动神经元培养

1. 将运动神经元（MNs）稀释至适当密度，通常在24孔板中每孔加入500 µL培养基，含5,000至10,000个细胞。
   注意：6孔板和96孔板的接种密度分别约为30,000和1,500个细胞。
2. 使用P1000移液器吸除层粘连蛋白（laminin）溶液。
3. 立即将稀释于培养基中的运动神经元（MNs）转移至包被好的培养板中，避免干燥。
4. 在37 °C条件下培养2天。

3. 运动神经元的磁转染

注意：以下步骤中使用的量适用于24孔板的一个孔的转染。如需其他规格，请参考生产商的说明书。

1. 进行DNA制备时，将1 µg DNA重悬于50 µL神经元培养基中，涡旋振荡5秒。此处使用带有CAGGS启动子（pCAGEN）控制神经丝蛋白cDNA的9 kb质粒。
2. 进行磁珠管制备时，将1.5 µL磁珠重悬于50 µL神经元培养基中。
3. 将50 µL磁珠溶液加入50 µL DNA溶液中，室温孵育20分钟（总体积 = 100 µL）。
4. 孵育期间，从将要转染的孔中吸出100 µL培养基。
   注意：将磁力板放入培养箱中，使其预热至37 °C。
5. 将100 µL DNA/磁珠混合液转移至孔中，并将培养板置于37 °C磁力板上孵育20–30分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒 pCAGEN	Addgene	#11160
神经元细胞培养基	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus 培养基
多聚-DL-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P8638
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
碳酸氢钠	ThermoFisher Scientific	25080094
L-15 培养基	ThermoFisher Scientific	11415056
PBS（无 Ca、Mg）	ThermoFisher Scientific	14190144	不含 Mg²⁺、Ca²⁺
圆形盖玻片	NeuVitro, Knittel glass	GG-12-Pre	12 mm