逆转录病毒介导的基因转导：利用基因工程逆转录病毒载体在培养细胞中递送转基因的一种基因转移技术 关键词：逆转录病毒，基因转导，基因转移，转基因，病毒载体，培养细胞

摘要

来源：Jacquier, A. 等 建模夏科-马里-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元 视频实验杂志 (2019)

在本视频中，我们展示了在原代神经元细胞培养中进行磁引导转染质粒DNA的方法。磁转染技术利用外部磁场，引导与磁性纳米颗粒结合的质粒进入细胞胞质。

方案

1. 准备逆转录病毒载体

1. 将T细胞受体（TCR）α链和β链通过2A连接子连接后，亚克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体中（例如pMIAII或pMIGII）。
   注意： 2A连接子可实现从单一开放阅读框中等化学计量比且协调地表达α链和β链TCR。该载体包含一个IRES荧光蛋白盒（ametrine或GFP），用于追踪转导细胞及评估转导效率。
2. 使用 commercially available 质粒提取试剂盒或类似产品分离质粒DNA。工作浓度为1-2 μg μl^-1。

2. 逆转录病毒生产细胞系的建立

1. 采用两步法构建逆转录病毒生产细胞系。
   1. 通过将三种质粒（pVSVG、pEQ-Pam3(-E) 和目的载体）瞬时转染 293T 细胞来产生逆转录病毒，并收集 293T 细胞的病毒上清液，用于转导 GP+E86 嗜同性逆转录病毒生产细胞系。
   2. 通过 FACS 分选荧光表达最强的前 40% GP+E86 生产细胞，并扩增这些被转导的 GP+E86 生产细胞作为病毒来源。
      注意： 高滴度病毒生产细胞系的构建对于骨髓细胞的高效转导至关重要。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM，高糖 + 谷氨酰胺	Corning Cellgro	10-013-CV	含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的伊格尔改良培养基 & 丙酮酸钠
FBS	Atlanta Biological	S11550
胰蛋白酶-Versene	Lonza	17-161F
0.45 μm 注射器滤器	赛默飞世尔科技	194-2545
Polybrene	Sigma	H9268-10G	用 dH2O 无菌过滤
环丙沙星	VWR	AAJ61970-06
丙酮酸钠	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM非必需氨基酸	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M 溶液	Corning Cellgro	25-060-CI
L-谷氨酰胺	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm 组织培养皿	Greiner Bio-one	639160
组织培养处理的6孔平底板	Greiner Bio-one	657160
70 μm 尼龙细胞滤器	Falcon	352350
小鼠 IL-3	Invitrogen	PMC0033
人IL-6	Invitrogen	PHC0063
小鼠干细胞因子	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS 缓冲液	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml 注射器	BD	300912
BD 1 ml 注射器	BD	309659
27 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头	BD	305109
30 G × 1/2 BD Precision Glide 针头	BD	305106