油红O染色：一种用于体外检测肝细胞中性脂质以识别肝脂肪变性的技术

摘要

来源：Campos-Espinosa, A. 等, 一种实验性脂肪变性的模型 体外脂质超载条件下培养基中的肝细胞培养。 J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示 体外 通过中性脂质染色检测肝细胞中的肝脂肪变性或肝脏脂肪过度积聚。细胞内以脂滴形式积聚过量脂肪。油红O是一种脂溶性染料，可结合脂滴内的细胞内中性脂质。在光学显微镜下观察时，这些细胞内脂滴呈现深红色。

方案

1. 使用油红O进行脂质染色

1. 在24孔板的每个孔中放入一个细胞培养盖玻片。
2. 每孔接种100,000个HepG2细胞，加入1 mL标准RPMI 1640培养基。
3. 在37 °C、5% CO2条件下预孵育24小时。
4. 将标准 RPMI 1640 培养基更换为促脂肪生成培养基。
5. 孵育24小时、2天、3天和4天，每隔24小时更换一次致脂肪变性培养基。
6. 在适当时间后，弃去上清液。
7. 用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，弃去上清液。
8. 用 1 mL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定。
9. 室温孵育1小时。
10. 弃去多余的多聚甲醛。
11. 用1 mL蒸馏水冲洗细胞。
12. 加入1 mL 70%异丙醇，孵育5分钟。
13. 弃去多余的异丙醇。此时无需用PBS洗涤。
14. 加入1 mL 油红O溶液，孵育30分钟。
15. 弃去多余的油红O溶液。
16. 用1 mL蒸馏水冲洗。
17. 加入500 µL苏木精溶液，孵育3分钟。
18. 弃去多余的苏木精溶液。
19. 用1 mL蒸馏水冲洗。
20. 在显微镜下以400倍放大倍数（物镜40倍，目镜10倍）进行观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基 RPMI 1640	赛默飞世尔-吉布科，美国	31800-022	-
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔-Gibco，美国	A4766801	-
HepG2细胞系	ATCC，美国	HB-8065	人肝细胞癌细胞
加湿培养箱	美国热电公司	型号：3110	温度（37 °C ± 1 °C），湿度（90%） ± 5%)，CO2（5% ± 1%)
倒置显微镜 Eclipse	尼康，日本	型号：TE2000-S	-
异丙醇	Sigma-Aldrich，美国	I9030-4L	-
Oil Red O 试剂盒	Abcam，美国	ab150678	中性脂肪组织学可视化试剂盒
多聚甲醛	Sigma-Aldrich，美国	P6148-500G	-
青霉素/链霉素	ThermoFisher-Gibco，美国	15140-122	抗生素 10,000 U/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher-Gibco，美国	10010-023	-
血清移液管	Sarstedt，澳大利亚	86.1253.001	非致热原，无菌，5 mL
血清移液管	Sarstedt，澳大利亚	86.1254.001	无热原、无菌、10 mL
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich，美国	S5761-1KG	培养基的制备
油酸钠	Santa Cruz Biotechnology，美国	sc-215879A	-
棕榈酸钠	Santa Cruz Biotechnology，美国	sc-215881	-
0.05% 胰蛋白酶 / 0.53 mM EDTA	康宁，美国	25-052-Cl	-
24孔细胞培养板	康宁，美国	3524	平底带盖。经组织培养处理。无热原，聚苯乙烯材质，无菌。1个/包。