尼罗红染色：一种用于检测和定量藻类细胞内中性脂质的技术

摘要

来源：Storms, Z. J. 等. 利用荧光法快速简便测定藻类细胞中中性脂质的实验方案. J. Vis. Exp. (2014)

本视频演示了一种通过尼罗红染料染色来检测和定量藻类细胞中中性脂质的实验方案。

方案

1. 使用尼罗红进行中性脂质的荧光定量

注意：进行荧光检测仅需 10 µl 浓度为 5 g/L 的藻类悬浮液。通常，从 1.5 ml 培养液中分离得到的干藻类生物量已完全足够。此外，分光光度计中光源的光强可能随时间推移而衰减。建议每次实验均包含标准样品，以确保仪器波动不会为测量结果引入不必要的误差。

1. 配制尼罗红溶液，浓度为10 µg/ml，溶剂为试剂级乙醇。将该溶液避光保存于4 °C。
2. 用去离子水配制30% (v/v) 乙醇溶液，并于4 °C保存。
3. 将所有藻类样品调整至相同的生物量浓度（推荐5 g/L），并以与测量所用标准品相同的方式制备。可通过将预干燥样品悬浮于适量磷酸盐缓冲液（0.6 g/L 磷酸氢二钾，1.4 g/L 磷酸二氢钾）中，或在测定浊度后用磷酸盐缓冲液将生长中的藻类培养物浓度调节至5 g/L来实现。
   注意：对活体藻类培养物进行测量时，其误差通常较大，具体取决于浊度校准曲线的精确度。重新悬浮干燥样品可能需要使用均质器以充分分散生物量。
4. 对于每个样品，在96孔板的单个孔中混合80 µl 30%乙醇溶液、10 µl尼罗红溶液和10 µl藻类悬浮液。为准确反映荧光测量的变异性，每份样品需进行5次重复。
5. 使用标准品进行两点校准曲线测定，以校正仪器和样品制备过程中每日之间的差异。标准品的制备方法应与样品相同。
   ​注意：通常两点足以完成仪器重新校准，也可使用三点以验证线性关系。
6. 在多功能酶标仪分光光度计中进行荧光测定。以下条件可获得最一致的结果：
   1. 以1,200 rpm转速振荡，轨道直径3 mm，持续30秒。
   2. 在40 °C孵育10分钟。
   3. 以1,200 rpm转速振荡，轨道直径3 mm，持续30秒。
   4. 记录荧光信号，激发波长530 nm，发射波长604 nm。
7. 利用内标品的结果将荧光测定值转换为油脂含量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 ml 一次性移液管	Fisher	13-676-10K
移液球	Fisher	13-681-51
1.5 ml 微量离心管	Fisher	05-408-129
40 ml 离心管（FEP）	Fisher	05-562-16A	也可使用玻璃管
巴斯德玻璃移液管	Fisher	13-678-20C
尼罗红	Sigma	N3013-100MG
乙醇（分析纯酒精）	Fisher	AC65109-0020
Leica DMRXA2（或同等型号）显微镜	Leica	DMRXA2
荧光多孔板读板仪	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascen
荧光读板仪软件	Thermo Lab Systems	Ascent 软件 2.6
COSTAR 96孔圆底板	Fisher	06-443-2