主动脉血管平滑肌细胞的Von Kossa染色：一种评估动脉中膜层钙化的体外技术

摘要

来源：O'Rourke, C., 等. 血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症的成像. J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了一种用于评估血管平滑肌细胞体外动脉中膜钙化的染色技术。von Kossa 法利用光化学反应在钙化部位沉积金属银，从而呈现黑色着色。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 试剂的准备

1. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离与钙化
   1. 主动脉消化液：
      1. 使用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）配制新鲜溶液（每根收获的主动脉约需 3–5 ml），其中含 175 U/ml II 型胶原酶和 1.25 U/ml 弹性蛋白酶。使用 0.22 µm 真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌，并在使用前置于冰上保存。
   2. 细胞培养基：
      1. 在 500 ml 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。
   3. 钙化培养基：
      1. 钙化培养基 A（NaPhos；用于小鼠细胞系）：
         1. 根据需要在 100–500 ml DMEM 中添加 10% 胎牛血清、2 mM 磷酸钠、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。
            或
      2. 钙化培养基 B（βGP/Asc/DEX；....

结果

图1：野生型小鼠主动脉的代表性解剖图。（A）去除覆盖器官及主动脉周围脂肪后，显示从胸主动脉至腹主动脉并延伸至髂总动脉分叉处的图像。（B）主动脉弓的局部放大图，可见头臂干、左颈总动脉和左锁骨下动脉。比例尺 = 1 mm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 锥形管	Falcon	352096
α-平滑肌肌动蛋白抗体	Sigma	SAB2500963
细胞培养腔载玻片	Nunc Lab-Tek	154461
II型胶原酶 	Worthington	LS004176
地塞米松	Sigma	D4902
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life Technologies	11965-084
弹性蛋白酶	Sigma	E1250
胎牛血清	Gibco	16000-044
精细尖头镊子	Roboz	RS-4972
全弧形带齿镊子	Roboz	RS-5138
甲醛溶液（10%）	Electron Microscopy Sciences	15740
汉克平衡盐溶液	Gibco	14025-092
带针头的胰岛素注射器	Terumo	SS30M2913
L-抗坏血酸	Sigma	A-7506
微型弹簧解剖剪刀（13 mm）	Roboz	RS-5676
微型弹簧解剖剪刀（3 mm）	Roboz	RS-5610
生理盐水	Hospira	0409-4888-10
核固红	Sigma-Aldrich	N3020
青霉素/链霉素	Corning	30-001-CI
硝酸银（5%）	Ricca Chemical Company	6828-16
磷酸氢二钠七水合物	Sigma-Aldrich	S-9390
硫代硫酸钠	Sigma	S-1648
ß-甘油磷酸二钠盐水合物	Sigma	G9422
组织培养瓶，25 cm²	Falcon	353108
组织培养板（35 mm × 10 mm）	Falcon	353001
六孔组织培养板	Falcon	353046
胰蛋白酶	Corning	25-053-CI
真空驱动过滤系统	Millipore	SCGP00525