主动脉血管平滑肌细胞的Von Kossa染色：一种评估动脉中膜层钙化的体外技术

摘要

来源：O'Rourke, C., 等. 血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症的成像. J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了一种用于评估血管平滑肌细胞体外动脉中膜钙化的染色技术。von Kossa 法利用光化学反应在钙化部位沉积金属银，从而呈现黑色着色。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 试剂的准备

1. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离与钙化
   1. 主动脉消化液：
      1. 使用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）配制新鲜溶液（每根收获的主动脉约需 3–5 ml），其中含 175 U/ml II 型胶原酶和 1.25 U/ml 弹性蛋白酶。使用 0.22 µm 真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌，并在使用前置于冰上保存。
   2. 细胞培养基：
      1. 在 500 ml 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。
   3. 钙化培养基：
      1. 钙化培养基 A（NaPhos；用于小鼠细胞系）：
         1. 根据需要在 100–500 ml DMEM 中添加 10% 胎牛血清、2 mM 磷酸钠、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。
            或
      2. 钙化培养基 B（βGP/Asc/DEX；可用于小鼠或人源细胞系）：
         1. 根据需要在 100–500 ml DMEM 中添加 10% 胎牛血清、10 mM β-甘油磷酸二钠、50 µg/ml L-抗坏血酸、10 nM 地塞米松、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。

2. 小鼠解剖

1. 以200 mg/kg剂量经腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠。
2. 将动物仰卧置于解剖板上，并用胶带固定每只爪子以稳定。在解剖显微镜下使用小剪刀，从下腹部至胸腔上部做一条沿中线的切口。
3. 用镊子剥离皮肤并移除腹膜，暴露腹腔器官。小心移除胃肠道器官，注意不要切断主动脉。
4. 在膈肌前部做一横向切口，并沿腹部继续延伸切口。使用解剖剪沿肋骨两侧剪断肋骨，并去除附着在胸骨上部的软组织，从而游离胸廓。移除胸廓，暴露肺脏。
5. 最初保留心脏原位（以帮助识别和解剖近端主动脉），并小心移除肺脏。仔细移除胸腺、气管和食管，确保主动脉保持完整。
6. 使用直头精细镊子和显微解剖剪，从髂动脉分叉处至主动脉弓逐段剥离主动脉周围的软组织，在清除主动脉周围脂肪时需格外小心图 1A）。清除主动脉弓大分支周围残留的脂肪和软组织（即，头臂干、颈总动脉和锁骨下动脉， 图1B).
   注意： 去除主动脉周围的脂肪非常重要，因为脂肪在进行荧光成像时会增加背景信号。
7. 从胸腔中取出心脏，小心地将其从近端主动脉分离并弃去。在髂动脉分叉处横断远端主动脉。使用胰岛素针头从主动脉弓处向主动脉内注射生理盐水，以冲洗残留的血细胞。连同主动脉弓的分支血管一起分离主动脉，将其完整地从体内移除。
8. 将主动脉置于冰上的生理盐水中，直至准备成像。

3. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的原代分离

1. 将主动脉置于冷的HBSS中，直至完成解剖。仔细切除残留的主动脉周围脂肪和软组织，仅保留主动脉。
2. 在无菌细胞培养罩内，将主动脉转移至35 mm × 10 mm细胞培养皿中的主动脉消化液中。置于37 °C培养箱中，轻轻间歇性摇动消化30分钟。消化完成后，主动脉呈现拉伸或松散的外观。
3. 在解剖显微镜下使用无菌镊子去除主动脉外层的外膜层，同时保持中膜层完整。去除外膜的一种技术是在主动脉一端剥离外层，并像脱袜子一样将其从下方的中膜层上剥离并移除。
4. 外膜层去除后，将剩余的主动脉放入含有细胞培养基的新细胞培养皿中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2–4小时。
5. 在无菌罩内，使用无菌3 mm显微解剖剪将主动脉切成1–2 mm宽的环状片段。
6. 将这些环状片段放入含有主动脉消化液的新细胞培养皿中，于37 °C轻轻间歇性摇动孵育120分钟。孵育期间多次上下吹打溶液，以重悬细胞。
7. 向消化液中加入5 ml预热的细胞培养基，并转移至15 ml锥形离心管中。
8. 以200 × g离心5分钟。
9. 吸除上清液，并将细胞重悬于所需体积的细胞培养基中（例如，5 ml）。
10. 将每根主动脉分离所得的全部细胞接种至25 cm²细胞培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。采用前述标准技术进行细胞传代。在最初7–10天的培养期间，每72–96小时更换一次培养基。当细胞接近汇合时，更频繁地补充培养基（每48小时一次）。
    注意：可能需要数周时间才能获得足够数量的细胞。
11. 细胞汇合后，使用预热至37 ^°C 的胰蛋白酶进行传代。
    1. 向每个培养瓶中加入0.5–1.0 ml胰蛋白酶，孵育3–5分钟；根据需要每30–60秒轻轻敲击瓶壁，以使细胞从表面脱落。
    2. 当细胞从瓶底脱落时，向含胰蛋白酶的细胞中加入10 ml细胞培养基。以200 × g离心5分钟。吸除上清液（含培养基和胰蛋白酶）。将细胞沉淀重悬于所需体积的新鲜细胞培养基中（例如，5–10 ml），并转移至新培养瓶中（部分细胞可转移至腔室载玻片）。
12. 在细胞首次传代时，采用前述标准免疫细胞化学技术，使用针对α-平滑肌肌动蛋白的抗体，确认平滑肌细胞谱系。

4. 诱导培养的平滑肌细胞钙化

1. 将3.12中获得的细胞以每孔2.0 ml细胞培养基的总体积接种于6孔板中。
   注意：建议每孔起始接种量为1 × 10⁵ 个细胞。
2. 将细胞在6孔板中于钙化培养基A或B中培养至少7天。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
3. 每48小时更换一次细胞培养基。

5. 使用 von Kossa 染色法评估血管平滑肌细胞钙化

注意：用于检测组织或培养细胞胞外基质钙化的方法——冯科萨（von Kossa）染色法，其原理是利用银离子取代与磷酸盐结合的钙离子。在光照和有机化合物存在条件下，银离子被还原为金属银并显色。未反应的银离子可通过硫代硫酸钠处理去除。冯科萨染色的具体操作步骤如下：

1. 从细胞培养板中吸去培养基。
2. 在室温下用 1 ml 10% 福尔马林固定细胞 20 分钟。
3. 移除福尔马林，并用蒸馏水洗涤固定后的细胞 5 分钟。
4. 将细胞置于 60–100 W 灯泡下，加入 1 ml 5% 硝酸银溶液孵育 1–2 小时。
5. 吸去硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤 5 分钟。
6. 用 1 ml 5% 硫代硫酸钠（w/v）水溶液处理细胞 5 分钟，以去除未反应的银。
7. 用蒸馏水冲洗细胞 5 分钟，重复洗涤 3 次。此时 von Kossa 染色样本已可使用标准倒置光学显微镜进行成像。
8. 可选步骤：用 1 ml 细胞核快红染液复染 5 分钟，随后用蒸馏水洗涤三次（每次 5 分钟）。

结果

图1：野生型小鼠主动脉的代表性解剖图。（A）去除覆盖器官及主动脉周围脂肪后，显示从胸主动脉至腹主动脉并延伸至髂总动脉分叉处的图像。（B）主动脉弓的局部放大图，可见头臂干、左颈总动脉和左锁骨下动脉。比例尺 = 1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 锥形管	Falcon	352096
α-平滑肌肌动蛋白抗体	Sigma	SAB2500963
细胞培养腔载玻片	Nunc Lab-Tek	154461
II型胶原酶 	Worthington	LS004176
地塞米松	Sigma	D4902
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life Technologies	11965-084
弹性蛋白酶	Sigma	E1250
胎牛血清	Gibco	16000-044
精细尖头镊子	Roboz	RS-4972
全弧形带齿镊子	Roboz	RS-5138
甲醛溶液（10%）	Electron Microscopy Sciences	15740
汉克平衡盐溶液	Gibco	14025-092
带针头的胰岛素注射器	Terumo	SS30M2913
L-抗坏血酸	Sigma	A-7506
微型弹簧解剖剪刀（13 mm）	Roboz	RS-5676
微型弹簧解剖剪刀（3 mm）	Roboz	RS-5610
生理盐水	Hospira	0409-4888-10
核固红	Sigma-Aldrich	N3020
青霉素/链霉素	Corning	30-001-CI
硝酸银（5%）	Ricca Chemical Company	6828-16
磷酸氢二钠七水合物	Sigma-Aldrich	S-9390
硫代硫酸钠	Sigma	S-1648
ß-甘油磷酸二钠盐水合物	Sigma	G9422
组织培养瓶，25 cm²	Falcon	353108
组织培养板（35 mm × 10 mm）	Falcon	353001
六孔组织培养板	Falcon	353046
胰蛋白酶	Corning	25-053-CI
真空驱动过滤系统	Millipore	SCGP00525