基于胶囊的病毒样本负染技术在透射电镜载网上的应用：一种用于观察包膜病毒超微结构的重金属染色技术

摘要

来源：Blancett, C. D.，等。在生物安全 containment 条件下利用胶囊法对病毒样本进行负染色。 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了在生物安全防护环境中利用处理胶囊对包膜病毒样本进行负染色的方法。通过透射电子显微镜观察经负染色处理的病毒，可对病毒的结构与形态进行纳米级分辨率的研究。

方案

1. 使用2%戊二醛在生物安全防护条件下进行灭活的胶囊法，随后在BSL-2实验室中进行负染色

1. 病毒灭活程序。 
   1. 在生物安全柜内，将病毒悬液与等体积的4%戊二醛充分混合，使戊二醛终浓度为2%。
      注意：戊二醛为危险化学品，操作时需采取适当防护措施。戊二醛可在普通生物安全柜中短时间使用，但若需长时间敞口操作，则必须在带管道的生物安全柜或化学通风橱中进行。
   2. 使用固定剂对病毒灭活至少24小时，之后进行包装、去污，并转移至BSL-2电镜设施。
2. 在BSL-2电镜设施中，将病毒与固定剂的混合液吸入连接于移液器上的胶囊中，该胶囊内含两个透射电镜（TEM）载网。
3. 将移液器水平放置10分钟，确保载网处于水平方向。
   注意：此步骤旨在促进病毒颗粒在TEM载网上均匀分布。
4. 拿起移液器，按压推杆将病毒溶液排入废液容器中。向胶囊内吸入40 μL去离子水，再排入废液容器，重复此清洗步骤共3次。
5. 向胶囊内吸入40 μL的1%醋酸铀（UA）或1%磷钨酸钾（PTA），染色30秒。
   注意：染色时间可根据病毒样本情况在10秒至1分钟之间调整。
   注意：UA为α射线发射体，且具有累积毒性，操作时需采取适当防护措施。
6. 从移液器上取下胶囊，用滤纸边缘轻触载网边缘以吸去多余液体，使载网自然干燥后保存，用于后续TEM成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Formvar/碳膜包被透射电镜载网	SPI	3420C-MB	200目铜网，每包100个
mPrep/g胶囊	EMS	85010-01	盒装
mPrep/f连接器	EMS	85010-11	标准型，每包16个
戊二醛	EMS	16320	50%溶液，电镜级
醋酸铀酰	EMS	22400	粉末
磷钨酸钾	EMS	19500	粉末
滤纸	Whatman	1450-090	50号
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1011	TEM