软组织样本的伊红染色：一种基于伊红的全小鼠肾脏染色方法，用于可视化特定组织微结构

摘要

来源：Busse, M. 等，使用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像。https://www.jove.com/v/60251 J. Vis. Exp. （2019年）

本视频演示了对完整小鼠肾脏进行酸化处理并固定后，再进行伊红Y染色的实验步骤。这种特异性针对细胞质的伊红染色方法有助于观察和识别组织中的解剖结构。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 伊红染色方案

1. 为了固定软组织样本，取一个50 mL离心管，加入固定液，其中包含9.5 mL的4%（v/v）甲醛溶液（FA）和0.5 mL冰醋酸（AA）。
   注意： 请使用37%无酸甲醛溶液（含约10%甲醇作为稳定剂）现配FA溶液，并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释。选择不含钙和镁的DPBS。稀释后的FA溶液保存时间不得超过一个月。酸化过程中，固定液的pH值会从中性降至约3。
   警告： 由于甲醛具有急性器官毒性、腐蚀性和致癌性，操作时必须使用通风橱，并穿戴适当的个人防护装备。
   1. 将新鲜取出的软组织样本放入50 mL离心管中，于4°C冷藏固定24–72小时。
      注意： 此处可暂停实验流程。
   2. 用DPBS溶液清洗软组织样本1小时。
2. 对已固定的软组织样本（例如完整的小鼠肾脏）进行染色时，将组织置于2 mL伊红Y染色液中，于室温孵育24小时。孵育过程中将样本放置在水平摇床上，保持轻柔振荡（约60 rpm）。
   注意： 伊红Y染色液的浓度为30%（w/v），溶剂为蒸馏水。染色液体积应足以完全覆盖样本，并确保样本在容器内可自由移动。其他类型样本的孵育时间可能不同，需相应调整。
3. 染色完成后，小心地从容器中取出软组织样本。
   1. 用滤纸小心吸除多余的染色剂。
   2. 将软组织样本置于锥形样本容器中，放置于乙醇蒸气相环境中保存并用于后续实验。
      注意： 锥形样本容器底部必须始终保留少量70%（v/v）乙醇，以保持软组织样本湿润，防止产生人为假象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml 离心管，Falcon 品牌	VWR	734-0453
甲醛溶液，37%	Carl Roth	CP10.2	无酸，以约 10% 甲醇稳定
冰醋酸	Alfa Aesar	36289.AP
伊红 Y 二钠盐	Sigma-Aldrich	E4382	经生物染料委员会认证
磷酸盐缓冲液（PBS）	Merck	L1825	Dulbecco 配方，不含钙和镁
Nalgene 样品管	Carl Roth	ATK5.1
rocking shaker ST5 摇床	CAT	60281-0000
纤维素滤纸	VWR	115-0600
Eppendorf 微量离心管	VWR	211-2120	安全锁设计，2.0 ml
Baker Analyzed 品牌无水乙醇	VWR	80252500
Sterilin 品牌培养皿
镊子，USBECK Laborgeräte 品牌	VWR	232-0096
塑料巴斯德吸管	Carl Roth	EA68.1	带刻度，1 ml