石蜡包埋组织切片的苏木精-伊红染色：利用苏木精与伊红染料组合对肝组织切片进行可视化的差异染色技术

摘要

来源：Ellis, J. L 等，斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析，J. Vis. Exp. (2017)。

在本视频中，我们介绍了一种对石蜡包埋的组织切片进行苏木精-伊红染色以研究其组织学结构的技术。该操作步骤包括对组织进行脱蜡，随后对组织中的细胞进行染色。染色后，细胞核呈明显的蓝色，而细胞质中的蛋白质则呈现粉红色。

方案

1. 染色液的配制

1. 过滤苏木精原液，以去除已析出的任何固体。
2. 将咖啡滤纸对折，使其形成一个圆锥形。打开侧面接缝，使液体流过滤纸，从而截留任何杂质。
3. 将滤纸放入漏斗中，并将漏斗置于玻璃培养液瓶上。缓慢将苏木精原液倒入漏斗中。
   注意：苏木精在接触眼睛、摄入或吸入时具有危害性。操作原液时务必穿戴实验服和手套，并在化学通风橱中进行。
4. 通过将125 µL的12 N HCl加入250 mL的ddH₂O中，配制0.05% HCl溶液。
5. 在玻璃瓶中混合25 mL 1%伊红Y（水溶液）、2.5 mL 1%荧光红B（水溶液）、195 mL 95%乙醇和1 mL冰醋酸，配制伊红Y-荧光红B溶液混合液。轻轻旋转混匀，并在室温下保存。
   注意：伊红Y在接触眼睛、摄入或吸入时具有危害性。操作原液时务必穿戴实验服和手套，并在化学通风橱中进行。
6. 通过将2 mL纯乙醇加入98 mL蛋水中，配制2%乙醇溶液。
   注意：乙醇对眼睛具有刺激性。操作乙醇时务必佩戴适当的个人防护装备。乙醇还具有易燃性，应相应地进行操作和储存。
   注：每次进行急性乙醇处理前，均需新鲜配制2%乙醇溶液。

2. 石蜡切片的苏木精和伊红染色

1. 将切片浸入100%二甲苯中15分钟以脱蜡；更换为新鲜的100%二甲苯，再处理15分钟。
2. 将切片依次浸入下列梯度乙醇溶液中进行再水化，直至液体能干净地从切片上流下。每种溶液中浸入8–10次，每次2秒：100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇，最后为去离子水。
   注意：本步骤后可暂停实验流程，切片可在水中室温放置数小时。如有需要，切片也可在水中4 °C过夜保存。
3. 将切片放入100%过滤后的哈里斯苏木精中染色4分钟。立即将切片转移回盛有去离子水的容器中。将去离子水注入容器远离组织切片的一侧角落。定期更换容器中的水，直至水不再呈紫色。
   注意：切勿让水流直接冲刷切片，以免组织脱落。
4. 使用解剖显微镜配合鹅颈灯快速检查苏木精染色强度；切勿让切片干燥。若染色强度已达到预期，则进入下一步。若颜色不够深，将切片再次放入100%苏木精中1分钟，重复水洗后再行检查。
   注意：苏木精染色需足够深，以确保在后续伊红染色过程中不褪色。然而，若在细胞质中观察到苏木精着色，则表明切片染色过度。
5. 将切片浸入0.05% HCl中2次，随即转移回盛有洁净去离子水的容器中。倒掉水并重新加水，重复换水2次。
6. 将切片转移至95%乙醇中30秒，随后转移至另一新容器中的95%乙醇中再处理30秒。
7. 将切片放入伊红Y-品红B溶液中染色2分钟。将切片转移回前一步的95%乙醇容器中，迅速在解剖显微镜下检查染色强度。若染色充分，则进入下一步；若不足，则返回伊红溶液中再染30秒，再次检查，必要时重复此过程。
   注意：充分的伊红染色应呈明亮的粉红色，并与苏木精染色形成明显对比。检查显微镜下染色情况时，务必擦去切片背面残留的溶液，避免产生假性颜色。由于伊红溶液含95%乙醇，长时间停留在95%乙醇中检查可能导致部分染料被洗脱。
8. 将切片转移至100%异丙醇中15秒。更换为新鲜的100%异丙醇，再次处理15秒。重复此过程，共完成6次异丙醇洗涤。
   注意：异丙醇对眼睛和呼吸道具有刺激性。操作时务必佩戴适当的防护装备，避免溅洒。异丙醇易燃，应妥善储存和处理。
   注意：为节约试剂，仅丢弃第一次（最粉红）的异丙醇洗涤液。其余五次洗涤液分别收集于编号为1至5的瓶子中，供下次染色重复使用。重复使用时，从编号“1”的瓶子开始，使用后即丢弃；使用完“2”号瓶后，将其倒入“1”号瓶中，依此类推。最后一次洗涤必须使用新鲜的异丙醇。
9. 将切片放入100%二甲苯中3分钟。逐个取出切片，并加盖盖玻片。
   1. 加入足量封片剂覆盖组织区域，并将切片浸入100%二甲苯中。
      注意：此步骤可使封片剂表面平滑，并去除气泡。
   2. 将盖玻片贴附于切片底部。
      注意：封片剂应能自动将盖玻片拉至正确位置。若盖玻片未对齐或未完全贴合，可轻轻敲击使其就位。
   3. 用纸巾吸去多余的封片剂，直至仅剩一条细线。将纸巾浸入二甲苯后擦拭切片背面，去除滴落的封片剂。将切片平放于坚固但可移动的表面（如硬纸板）。以相同方式完成其余切片的封片。在通风橱中静置10分钟，使二甲苯完全挥发。
      注意：所有被二甲苯污染的材料均应取出，并密封存放于通风橱内的专用容器中，以防蒸气逸出。
10. 在室温下静置过夜，使封片剂完全固化。

3. 染色玻片的成像与保存

1. 在倒置复合显微镜下观察切片。
   注意： 载玻片可长期在室温下保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
95% 乙醇 (EtOH)	Decon Labs, Inc.	2801	易燃
带电荷的载玻片	Fisher Scientific	12-550-16
解剖显微镜	Leica Biosystems	Leica Mz 95
伊红-品红染色剂套装	Newcomer Supply	1082A
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	易燃
哈里斯苏木精	Poly Scientific R&D Corp.	s212	刺激性
盐酸 (HCl)	Fisher Scientific	A144	刺激性
异丙醇	Newcomer Supply	12094E	易燃
二甲苯	Fisher Scientific	X3S-4	刺激性