石蜡包埋组织切片的 H&E 染色:一种使用苏木精和伊红染料组合可视化肝组织切片的差异染色技术

Abstract

来源:Ellis， J. L et al.， 斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析。J. Vis. Exp. （2017 年）。

在本视频中，我们介绍了一种对石蜡包埋的组织切片进行苏木精和伊红染色的技术，以研究其组织学。该程序包括组织脱蜡，然后对组织中的细胞进行染色。染色后，细胞核呈明显的蓝色，细胞质中的蛋白质呈粉红色。

Protocol

1. 染色液的制备

1. 过滤 Harris 苏木精储备溶液以去除任何沉淀的固体。
2. 将咖啡过滤器对折，使过滤器形成一个圆锥体。打开侧面板，使液体流过过滤器，从而捕获任何碎屑。
3. 将过滤器放入漏斗中，将漏斗放入玻璃培养基瓶中。逐渐将苏木精原液倒入过滤器中。
   谨慎:苏木精在眼睛接触、摄入和吸入的情况下是危险的。始终穿着实验服和手套，并在化学罩中处理储备液。
4. 通过将 125 μL 的 12 N HCl 添加到 250 mL 的 ddH₂O 中来制备 0.05% HCl。
5. 通过将 25 mL 1% 伊红 Y （水溶液）、2.5 mL 1% 弗洛辛 B （水溶液）、195 mL 95% 乙醇和 1 mL 冰醋酸混合在玻璃瓶中制备伊红 Y-福洛辛 B 溶液混合物。旋转混合均匀，并在 RT
   下储存 谨慎:伊红 Y 在眼神接触、摄入和吸入的情况下是危险的。始终穿着实验服和手套，并在化学罩中处理储备液。
6. 将 2 mL 纯乙醇加入 98 mL 蛋水中，制备 2% 乙醇。
   谨慎:乙醇对眼睛有刺激性。处理乙醇时，请务必佩戴适当的防护设备。它也是易燃的，应相应地处理和储存。
   注意:在进行急性乙醇处理之前，每次都准备新鲜的 2% 乙醇。

2. 石蜡切片的苏木精和伊红染色

1. 将载玻片浸入 100% 二甲苯中 15 分钟，使载玻片脱蜡;将其换成新鲜的 100% 二甲苯再 15 分钟。
2. 通过将载玻片浸入以下系列的分级乙醇中来重新水化载玻片，直到液体从载玻片上干净地流出。对于每种溶液，浸渍 8-10 次，每次浸渍 2 秒:100% 乙醇、100% 乙醇、95% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇、30% 乙醇和去离子水。
   注意:该方案可以在此处停止，载玻片可以在 RT 中在水中放置数小时。如有必要，载玻片可以在 4 °C 下储存在水中 O/N。
3. 将载玻片放入 100% 过滤的 Harris 苏木精中 4 分钟。立即将它们转移回装有去离子水的容器中。将去离子水倒入容器最远离各部分的后角。定期清空容器，直到水不再呈紫色。
   注意:不要让水直接流到滑梯上，因为滑梯的部分可能会从滑梯上脱落。
4. 使用鹅颈灯在解剖显微镜上快速检查苏木精强度;不要让载玻片干燥。如果污渍已达到所需的强度，请继续进行下一步。如果颜色不够深，请将载玻片放入 100% 苏木精中 1 分钟，然后重复水洗，然后再次检查><。 注意:苏木精需要足够深，以便在伊红染色过程中不会失去颜色。但是，如果在细胞质中观察到苏木精染色，则切片会过度染色。
5. 将玻片浸入 0.05% HCl 中两次，然后立即用干净的去离子水将其转移回容器中。倒空水，然后将容器重新装满水两次。
6. 将载玻片转移到 95% 乙醇中 30 秒，然后将它们转移到含有 95% 乙醇的新容器中 30 秒。
7. 将载玻片放入伊红 Y-Phloxine B 溶液中 2 分钟。将载玻片转移回之前的 95% 乙醇容器中，并在解剖显微镜下快速检查颜色的强度。如果染色充分，请继续执行下一步。如果没有，请返回伊红溶液 30 秒，再次检查，并根据需要重复><。 注意:足够的伊红染色为亮粉色，与苏木精染色形成鲜明对比。在显微镜下检查时，请务必擦去载玻片背面的任何溶液，以免观察到伪色。因为伊红是由 95% 的乙醇组成的，所以在 95% 乙醇中长时间检查颜色强度可能会浸出一些颜色。
8. 将玻片转移到 100% 异丙醇中 15 秒。换上新鲜的 100% 异丙醇，然后将玻片放回异丙醇中再放置 15 秒。重复此过程，总共洗涤 6 次异丙醇。
   谨慎:异丙醇对眼睛和呼吸道有刺激物。始终确保佩戴适当的防护设备并避免飞溅。它还高度易燃，应相应地储存和处理><。 注意: 为了节省试剂，请仅丢弃第一次（最粉红色的）异丙醇洗涤液。将其他五种洗涤液保存在编号为 1 到 5 的瓶子中，以便在下次染色时重复使用。重复使用洗涤液时，请从编号为"1"的瓶子开始，使用后丢弃。使用洗液"2"后，将其倒入瓶子"1"中，依此类推。最后的洗涤应始终使用新鲜的异丙醇。
9. 将载玻片放入 100% 二甲苯中 3 分钟。一次取出一张载玻片并放置盖玻片。
   1. 添加足够的封固剂以覆盖切片，并将其浸入 100% 二甲苯中。
      注意:此步骤将平滑封固剂的表面并去除任何气泡。
   2. 将盖玻片贴在载玻片底部。
      注意:安装介质应将载玻片拉入到位。如果盖玻片不直或未完全就位，请轻轻敲击到位。
   3. 在纸巾上吸干多余的封固剂，直到只看到一条细线。将纸巾擦入二甲苯中，然后擦拭载玻片的背面以去除任何滴落的介质。将载玻片平放在坚固但可移动的表面上，如一块纸板。以相同的方式盖上所有剩余的载玻片。让二甲苯在通风橱中蒸发 10 分钟。
      注意:任何被二甲苯污染的材料都应取出并丢弃在通风橱中的密封容器中，以防止任何蒸气逸出。
10. 让封固剂在 RT O/N 处硬化。

3. 染色玻片的成像和储存

1. 在复合倒置显微镜上成像。
   注意:玻片可以无限期地保存在室温下。

Materials