亚甲蓝染色法用于体外评估转移性克隆形成：一种通过定量来自小鼠癌症模型的收获癌细胞来评估转移的染色步骤

摘要

来源：Nagai-Singer, M. A.，等。利用计算机图像分析改进4T1乳腺癌模型中肺转移的定量分析。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍亚甲蓝染色法，通过计数从注射后小鼠模型远端器官中分离的癌细胞经培养后获得的染色克隆，来定量评估转移负荷。

方案

所有动物模型实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 组织处理

注意：本节所有步骤均应采用无菌技术进行。

1. 为每只小鼠标记1个15 mL离心管，并在每管中加入2.5 mL IV型胶原酶混合液和30单位弹性蛋白酶。配制IV型胶原酶混合液的方法：将每毫升1×HBSS中溶解2 mg IV型胶原酶，经无菌过滤。该溶液可在-20 °C保存最长12个月，使用时解冻即可。
2. 将收获的小鼠肺组织转移至该样本对应的第二个洁净的1×HBSS孔中，用镊子轻轻搅动以去除残留血液。将清洗后的肺组织转移至一个空的3.5 cm组织培养皿中，用剪刀剪碎肺组织。用2.5 mL 1×HBSS冲洗培养皿，然后将HBSS及肺组织碎片转移至已含有胶原酶/弹性蛋白酶混合液（总体积5 mL）的15 mL离心管中。
3. 在4 °C孵育75分钟。在此期间持续混合样品，因此需将离心管置于摇床或旋转轮上。孵育过程中，为每只小鼠标记相应的50 mL离心管和10 cm组织培养皿。若需进行稀释，应为稀释样本准备足够数量的10 cm组织培养皿。
   注意：请标记组织培养皿的盖子。若在培养皿本体上标记，书写内容将干扰Fiji-ImageJ分析。
4. 用1×HBSS将每管体积补至总体积10 mL。将内容物倒入70 μm细胞滤器，滤入50 mL离心管中（每个样本对应一个）。使用1 mL注射器的推杆轻轻研磨样品，使其通过滤器，以促进更多细胞滤过。
5. 在室温（RT）下以350 × g离心5分钟。弃去上清液，并用10 mL 1×HBSS重悬沉淀，洗涤一次。重复此步骤两次。
6. 将沉淀重悬于10 mL 60 μM 6TG完全培养基（RPMI或IMDM）中。将样品接种至10 cm组织培养皿中，如需要可采用稀释方案。在37 °C、5% CO₂条件下孵育5天。
   注意：1:2、1:10和1:100为常见稀释比例，需根据实验参数通过实验确定。
   注意：6TG具有毒性，操作时应小心，并遵循所有环境健康与安全指南进行废弃物处理。

2. 染色平板

1. 将培养基从培养板中倒入适当的废液容器中。每块板加入5 mL未稀释的甲醇固定细胞，在室温下孵育5分钟，并确保轻摇甲醇使其覆盖整个板面。
   注意：甲醇若被摄入、吸入或接触皮肤具有危害性。此步骤应在通风橱中操作。
2. 将甲醇从培养板中倒入适当的废液容器中。每块板用5 mL蒸馏水冲洗一次，随后将水倒入适当的废液容器中。每块板加入5 mL 0.03%亚甲蓝溶液，在室温下孵育5分钟，并确保轻摇亚甲蓝溶液使其覆盖整个板面。
3. 将亚甲蓝溶液倒入适当的废液容器中。再次用每板5 mL蒸馏水冲洗培养板。将培养板倒置，用纸巾轻压以去除多余液体。将培养板置于其皿盖上，于室温下静置过夜自然干燥。
   注意：转移性克隆将呈蓝色。培养板干燥后可于室温长期保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲醇	Fisher Scientific	A412SK-4
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 培养基	ATCC	30-2001
摇床或旋转轮	任意	任意
带PES膜的无菌一次性滤器	ThermoFisher Scientific	568-0010
IV型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm 组织培养板	Nunclon	153066
10 cm 组织培养板	Fisher Scientific	08-772-22
15 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
1× Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Thermo Scientific	SH3026802
50 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
70 μm 细胞筛	Fisher Scientific	22-363-548
70% 乙醇	Sigma Aldrich	E7023	用去离子水稀释至70%
培养箱			需能维持5% CO2 和 37 °C
镊子	Roboz	RS-8100
离心机	任意	任意	需能提供125 × g 和 300 × g 的离心力
蒸馏水	任意	任意
弹性蛋白酶	MP Biomedicals	100617