细胞高碘酸-希夫染色:一种检测外周血单核细胞中糖原水平的体外技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 从全血中分离 PBMC

注意:在生物安全柜中使用无菌技术和制造商灭菌的设备执行此程序。

1. 小心地将肝素化（抗凝血剂）采血管中的 10-15 ml 全血倒入 50 ml 无菌锥形管中。对于轻微的血液溢出，使用清洁纸用 ddH₂O 和 70% 乙醇擦拭。
2. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS 1x） pH 7.4 将锥形管中的血液稀释至 1:1 的比例。确保最大总体积不超过 30 毫升。
3. 使用血清移液枪轻轻混匀，避免气泡。
   注意:请勿通过倒置试管来混合，以避免血液在瓶盖中积聚和随后在离心过程中渗漏。
4. 将 13 ml Ficoll-paque（参见材料表）加入新的 50 ml 容量锥形管中。将试管直立在架子上。
5. 使用移液管，吸取稀释的血液，将移液移液器吸头接触靠近顶部的试管内壁。以缓慢而稳定的压力，沿着管内壁转移血液，在蔗糖层顶部形成血层。执行此步骤几次，直到所有血液都已转移。
6. 盖紧试管，并在室温下以 700 x g 的水平在摆动转子中离心试管 30 分钟，中等加速度设置为 5，减速度设置为零。
7. 慢慢取出试管，在不打扰各层的情况下，将其带回生物安全柜。
8. 使用移液管小心收集 PBMC 所在的血沉棕黄层（薄薄的浑浊白色层），放置在 PBS/血浆层和 ficoll 层之间。避免收集蔗糖层，不要干扰红细胞层。
9. 将血沉棕黄层转移到新的 50 ml 无菌锥形管中。可能需要重复步骤 1.8 多次才能收集所有 PBMC。
10. 将 PBS pH 7.4 添加到装有 PBMC 的试管中，并填充至 45 ml 标记。彻底摇匀试管。不要涡旋。
11. 洗涤 1:以 480 x g 离心 15 分钟，最大加速度和减速度均设置为 9。观察锥形管底部 PBMC 颗粒的形成。
12. 将 PBS（上清液）丢弃到装有 10 ml 漂白剂的塑料烧杯中。
13. 通过在起伏的表面（即空架子）上轻轻"摇摆"来松开细胞沉淀。不要涡旋。
14. 向试管中加入 25 ml 新鲜 PBS pH 7.4。如果要处理多个试管，请在此步骤中将沉淀物汇集在一起。
15. 洗涤 2:以 480 x g 的速度离心试管 12 分钟，最大加速度和减速度均设置为 9。
将
16. PBS（上清液）丢弃到塑料烧杯中，并加入少许漂白剂。
17. 轻轻地将 "架" 在起伏的表面（即空架子）上。不要涡旋。
18. 向试管中加入 25 ml 新鲜 PBS。
    1. 取出 50 μl 细胞，转移到微量离心管中进行活力计数。
    2. 加入等量 （50 μl） 台盼蓝（活力染色剂），上下移液以轻轻混合。
19. 取出 10 μl 并将其转移到血细胞计数器中，以检查每毫升细胞的活力。记录细胞数/毫升。
20. 取出所需量的细胞，以 480 x g 离心管 12 分钟，最大加速度和减速度均设置为 9。
将
21. PBS（上清液）丢弃到装有漂白剂的烧杯中。
22. 轻轻地将 "架" 在起伏的表面（即空架子）上。将 80 μl PBS 加入试管中。

2. 制作 PBMC 幻灯片

1. 将 80 μl 细胞放在显微镜载玻片上。在另一张载玻片的帮助下涂抹液滴，或在载玻片的两端滴 2 滴各 40 μl。
2. 将载玻片留在生物安全柜中晾干。用铅笔在磨砂面上标记载玻片。

3. 修复幻灯片上的样本

1. 通过将 0.5 ml 37% 甲醛与 4.5 ml 99% 乙醇混合来制备固定液。
2. 载玻片干燥后，取出 2 ml 新鲜制备的固定液，倒在载玻片上，使载玻片的整个表面被覆盖。
3. 将溶液留在载玻片上 1 分钟。用自来水冲洗载玻片 1 分钟，然后风干。

4. 制备用于阴性对照的淀粉酶溶液

1. 取 0.25 g 淀粉酶粉末，溶于 50 ml 蒸馏水中。将溶液倒入干净的 100 ml 烧杯中。
2. 将载玻片浸入烧杯中，使载玻片的一半接受处理，另一半保持未处理，然后在室温下孵育 15 分钟（图 1C）。
3. 记下载玻片的哪一侧正在接受淀粉酶处理。在载玻片背面画一条线，指示治疗和对照之间的边界。
4. 用 ddH₂O 洗涤载玻片以去除淀粉酶溶液，然后让载玻片风干。

5. 执行高碘酸希夫 （PAS） 染色和成像

>注意:PAS 试剂吸入有毒且具有腐蚀性，因此需要在化学通风橱中完成这些步骤，并且必须根据机构指南妥善处理废物。

1. 将载玻片放在平坦的表面上，将 1.50-2.00 ml 高碘酸溶液倒在样品上。在室温下孵育 5 分钟。
2. 用蒸馏水冲洗玻片数次。
3. 将 1.50-2.00 ml 希夫试剂倒在载玻片上，并在室温下孵育 15 分钟。
4. 用蒸馏水清洗载玻片 5 分钟，然后风干。
5. 在载玻片上涂抹 10 μl 封固剂并用两个小盖玻片盖住，或涂抹 50 μl 并使用一个大盖玻片。
6. 将透明指甲油涂在盖玻片的边缘，晾干一夜。

6. 使用 100X 物镜的双目光学显微镜获取图像

图 1:PBMC 上 PAS 染色的分步方法。（A） 首先，通过 ficoll 梯度实现 PBMC 的分离，左图显示离心前的制备，右图显示离心后，在管中心观察到含有 PBMC 的血沉棕黄层。（B） 使用福尔马林-乙醇固定液将分离的 PBMC 固定在载玻片上。用塑料洗涤瓶中的蒸馏水轻轻冲洗玻片。 （C） 然后将玻片放入装满淀粉酶溶液的 100 ml 烧杯中，淀粉酶溶液将溶解糖原。轻轻冲洗玻片。 （D） 玻片用高碘酸溶液处理，其中糖类发生氧化。轻轻冲洗载玻片;这将去除多余的高碘酸并停止氧化步骤。（E） 当希夫试剂添加到玻片中时，它会与氧化步骤中产生的醛反应。这种无色试剂将产生深红色品红色产品。轻轻冲洗玻片以去除多余的 Schiff 试剂。