细胞的过碘酸-雪夫染色：一种体外检测外周血单个核细胞糖原水平的技术

摘要

来源：Tabatabaei Shafiei, M.，等。采用过碘酸雪夫染色法检测外周血单个核细胞中的糖原。J. Vis. Exp. (2014)。

本视频演示了过碘酸-雪夫染色法，用于体外评估外周血单个核细胞的糖原水平。该染色法使细胞内糖原颗粒呈现洋红色，从而可在显微镜下清晰观察。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从全血中分离外周血单个核细胞

注意：在生物安全柜中使用无菌技术并采用制造商灭菌的设备进行此操作。

1. 小心地将 10–15 ml 抗凝全血从肝素抗凝采血管转移至一个 50 ml 无菌锥形管中。对于少量血液溢出，用 ddH₂O 浸湿的纸巾擦拭即可。₂使用清洁纸巾用 O 和 70% 乙醇擦拭。
2. 将血液用磷酸盐缓冲液（PBS 1x，pH 7.4）按1:1比例稀释。确保总体积不超过30 ml。
3. 使用移液管枪轻轻混匀，避免产生气泡。
   注意： 切勿通过倒置试管混匀，以避免血液在管盖处积聚，导致离心过程中发生渗漏。
4. 加入13 ml Ficoll-paque（参见 材料表)，转移至一个新的50 ml离心管中。将离心管直立放置于管架中。
5. 使用移液管吸取稀释后的血液，将移液管管尖接触试管内壁靠近顶部的位置。以缓慢而稳定的压力，沿试管内壁将血液转移至蔗糖层上方，形成一层血液。重复此步骤数次，直至全部血液完成转移。
6. 盖紧管盖，于室温下在水平转子离心机中以700 × g离心30分钟，加速度设为5，减速度设为ZERO。
7. 缓慢取出试管，注意不要扰动各层，将其放回生物安全柜中。
8. 使用移液管小心收集位于PBS/血浆层与Ficoll层之间的白色云雾状薄层（即血沉棕黄层，含PBMCs）。避免收集蔗糖层，并勿扰动红细胞层。
9. 将白细胞层转移至一个新的50 ml无菌锥形管中。可能需要重复多次 步骤1.8 收集所有外周血单个核细胞。
10. 向含有PBMC的离心管中加入pH 7.4的PBS，定容至45 ml刻度线。充分振荡混匀，禁止涡旋振荡。
11. 洗涤步骤1：以480 × g离心15分钟，加速度和减速度均设置为9。观察锥形管底部外周血单个核细胞（PBMC）沉淀的形成。
12. 将 PBS（上清液）弃入含 10 ml 漂白剂的塑料烧杯中。
13. 通过在不平整的表面上轻轻“来回移动”来松解细胞沉淀即， 空架子）。不要涡旋震荡。
14. 向离心管中加入 25 ml 新鲜的 PBS（pH 7.4）。如果处理多个离心管，此步骤中将沉淀物合并在一起。
15. 洗涤2：将离心管在480 × g下离心12分钟，加速度和减速度均设为9。
16. 将 PBS（上清液）倒入含漂白剂的塑料烧杯中弃去。
17. 轻轻“倾斜”于波纹状表面（即， 空架子）。不要涡旋震荡。
18. 向试管中加入 25 ml 新鲜的 PBS。
    1. 取出 50 µl 细胞，转移至微量离心管中用于活率计数。
    2. 加入等量（50 µl）的台盼蓝（一种活率染色剂），轻轻吹打混匀。
19. 取出10 µl，转移至血细胞计数板，检测每毫升细胞的活力。记录每毫升的细胞数量。
20. 取出所需数量的细胞，将离心管以480 × g离心12分钟，离心时加速度和减速度均设置为9。
21. 将 PBS（上清液）弃入含漂白剂的烧杯中。
22. 轻轻“倾斜”于波纹状表面（即， 空架子）。向试管中加入 80 µl PBS。

2. 制备PBMC玻片

1. 取80 µl细胞悬液滴加到显微镜载玻片上，用另一张载玻片辅助涂布；或在载玻片两端各加一滴40 µl的细胞悬液。
2. 将载玻片置于生物安全柜中晾干。用铅笔在载玻片的磨砂端做好标记。

3. 在载玻片上固定样品

1. 通过将0.5 ml的37%甲醛与4.5 ml的99%乙醇混合，配制固定液。
2. 玻片干燥后，取2 ml新配制的固定液，滴加至玻片上，确保覆盖玻片的整个表面。
3. 让溶液在玻片上作用1分钟，然后用自来水冲洗玻片1分钟，并静置使其自然干燥。

4. 制备阴性对照用淀粉酶溶液

1. 取0.25 g淀粉酶粉末，溶于50 ml蒸馏水中。将溶液倒入洁净的100 ml烧杯中。
2. 将载玻片浸入烧杯中，使载玻片的一半接受处理，另一半保持未处理状态，然后在室温下孵育15分钟（图1C）。
3. 记录载玻片上接受淀粉酶处理的一侧。在载玻片背面画一条线，标示处理区与对照区的边界。
4. 用ddH₂O清洗载玻片以去除淀粉酶溶液，并将载玻片静置晾干。

5. 进行过碘酸雪夫（PAS）染色与成像

注意：PAS 试剂通过吸入具有毒性，且具有腐蚀性，因此操作步骤必须在化学通风橱中进行，并根据机构规定妥善处理废弃物。

1. 将载玻片置于平坦表面，加入 1.50–2.00 ml 过碘酸溶液覆盖样本，室温孵育 5 分钟。
2. 用数次蒸馏水冲洗载玻片。
3. 向载玻片加入 1.50–2.00 ml 希夫试剂，室温孵育 15 分钟。
4. 用蒸馏水洗涤载玻片 5 分钟，静置晾干。
5. 在载玻片上加入 10 µl 封片介质，并用两个小盖玻片覆盖；或加入 50 µl，使用一个大盖玻片。
6. 在盖玻片边缘涂上透明指甲油，室温静置过夜干燥。

6. 使用 100X 物镜通过双目光学显微镜获取图像

结果

图1：PBMC上进行PAS染色的逐步方法学。 (A) 首先通过Ficoll密度梯度法分离PBMC，左侧面板显示离心前的准备状态，右侧面板显示离心后的状态，其中含有PBMC的白膜层可见于试管中央。 (B) 使用甲醛-乙醇固定液将分离的PBMC固定于载玻片上。随后用塑料冲洗瓶中的蒸馏水轻轻冲洗载玻片。(C) 然后将载玻片置于盛有50 ml淀粉酶溶液的100 ml烧杯中，以溶解糖原。随后轻轻冲洗载玻片。(D) 载玻片用过碘酸溶液处理，使糖类发生氧化反应。轻轻冲洗载玻片，以去除多余的过碘酸并终止氧化步骤。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
过碘酸雪夫试剂盒	Sigma-Aldrich	395B	使用前需恢复至室温。本试剂盒中的材料具有毒性且有害，使用时需谨慎。
α-淀粉酶（来源于猪胰腺）	Sigma-Aldrich	A3176
双目显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
糖原检测试剂盒	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	非离子型蔗糖合成聚合物。
离心机			用于PBMC分离，使用摆动式转子。