结晶紫染色：利用克隆形成实验可视化耐药性癌细胞的技术

摘要

来源：Mohr, L. 等，抗有丝分裂药物多西他赛耐药前列腺癌细胞模型的建立。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了一种利用结晶紫染色法检测化疗药物耐药性癌细胞活力的实验方法。

方案

1. 通过集落形成实验对获得性多西他赛耐药性的功能表征

注意：在本方案中，采用集落形成实验评估了化疗耐药性。用于评估细胞活力的其他方法（即， MTS检测可根据研究者的偏好进行选择使用。

1. 在6孔板中每孔接种2,000个细胞（DU145或22Rv1，包括亲本株和多西他赛耐药株），每孔加入2 mL培养基。
2. 24小时后，向DU145和22Rv1细胞系中分别加入递增浓度的多西他赛（亲本细胞：0.25、0.5、1、2.5和5 nM；耐药细胞：50、125、250、500和1,000 nM）。设一孔仅加入与最高剂量多西他赛等体积的DMSO作为对照。
3. 72小时后，吸除含药培养基，更换为新鲜的不含多西他赛的培养基。
4. 继续培养1–2周，直至在显微镜下可见细胞克隆形成。
5. 染色克隆时，先用2–3 mL PBS轻轻洗涤，然后在生物安全柜或通风柜内加入2–3 mL结晶紫染色液（0.1% w/v，溶于10%甲醛溶液）孵育20分钟。
6. 移除染色液，用2–3 mL H₂O洗涤孔板，吸去H₂O后将孔板置于空气中自然晾干。
7. 通过肉眼观察各孔并借助记号笔辅助手动计数克隆（避免重复计数），计算细胞存活率百分比并以图表形式表示结果。拍摄孔板的数字图像用于图示展示（图1）。

结果

图1：多西他赛耐药细胞模型的功能与表型特征分析。亲代细胞与多西他赛耐药细胞在指定浓度多西他赛处理72小时后的代表性集落形成实验结果。附带图表显示了各处理浓度下的集落百分比。实验重复三次，数据表示为均值 ± 标准差（SD）。比例尺 = 5 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DU145 细胞 	ATCC 	HTB-81
22Rv1 细胞 	ATCC 	CRL-2505
多西他赛 	Selleck Chemicals 	S1148 	溶于 DMSO（10 mM）
6 孔组织培养板 	Falcon 	353046
RPMI 1640 培养基 	Gibco 	11875093	添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素
Foundation B 胎牛血清 	Gemini 	900208
1× 磷酸盐缓冲液（PBS） 	Corning 	21-040-CM
结晶紫 	Sigma-Aldrich 	C0775
10% 甲醛溶液 	Sigma-Aldrich 	HT501128