荧光银染：一种用于可视化聚丙烯酰胺凝胶中总蛋白的技术

摘要

来源：Wong, A. Y. H. 等. 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染法. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了一种使用荧光探针对聚丙烯酰胺凝胶进行银染的方法，以实现对总蛋白的可视化。

方案

1. 凝胶的制备

1. 使用小型凝胶电泳槽，以 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液浸没 4% - 12% Bis-Tris 蛋白凝胶（1 mm，15 孔），进行 SDS-PAGE 电泳。
2. 用去离子水、十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液和样品还原剂的混合液稀释样品。
3. 第一孔上样量为原液的两倍（10 µL），随后依次为正常原液量（5 µL）及原液的系列两倍稀释样品（共 13 个稀释度，从 2 倍至 8192 倍）。
4. 以恒定电压 200 V 电泳 30 分钟。

2. 凝胶的固定

1. 电泳结束后，将凝胶浸入含有 40% 乙醇/10% 乙酸的 100 mL 溶液中，在室温下以 50 rpm 的速度于摇床中孵育 2 次（每次 30 分钟），或在 4 °C 下过夜。
2. 在洁净容器中用超纯水清洗凝胶，每次 10 分钟，共清洗 3 次。此洗涤步骤至关重要。若固定液中的酸未被充分去除，则在荧光显影步骤中，过量的 TPE-4TA 会被酸激活，导致凝胶中出现强烈的背景荧光。

3. AgNO₃ 溶液的配制及凝胶的银染浸渍

1. 为制备浸渍用的 AgNO₃  溶液（0.0001%），首先将 0.01 g AgNO₃  溶解于 10 mL 超纯水中，配制 0.1% 的 AgNO₃  储备液。然后，取 100 µL 的 0.1% AgNO₃  储备液加入 100 mL 超纯水中，制成工作液。
   注意： AgNO₃  溶液在使用前应避光保存。
2. 将凝胶置于密封玻璃容器中，加入 100 mL 银工作液，在 50 rpm 条件下于轨道摇床上浸渍 1 小时。必须在通风橱内进行银浸渍操作，并用铝箔包裹容器以避光。
3. 在洁净容器中用超纯水（约 100 mL）清洗凝胶，每次 60 秒，共洗 2 次。

4. 凝胶的荧光显色

1. 配制染料储备液（0.1 mM）：将 3.0 mg 的 TPE-4TA 染料加入 50 mL 超纯水中。超声处理数分钟，并加入少量氢氧化钠溶液（例如 1 M）以促进染料溶解。
2. 在 365 nm 紫外灯下检测溶液的荧光，以确认染料分子是否完全溶解。只有当溶液荧光极弱或无荧光发射时，表明染料已完全溶解。
   注意：该染料 TPE-4TA 的合成方法参照 Xie 等 近期报道的实验方案。 TPE-4TA 溶液非常稳定，避光保存可维持数月。
3. 配制 100 mL 荧光显色液（10 µM）：将 10 mL  TPE-4TA 储备液加入 90 mL 超纯水中。使用 pH 计检测溶液 pH，并用氢氧化钠溶液（1 µM）调节 pH 至 7–9。
4. 将凝胶转移至洁净且可密封的容器中，加入 100 mL 荧光显色液，确保凝胶完全浸没于溶液中。密封容器，避光，在室温下以 50 rpm 转速于摇床中振荡过夜。或者，也可通过将 AIE 显色液预热至 80 °C 进行染色，随后在室温下静置，将孵育时间缩短至约 ~2 小时。

5. 脱色与成像

1. 将凝胶转移至洁净容器中，加入100 mL 10%乙醇溶液，脱色30分钟。 
   注意：可单独使用水清洗凝胶，但使用10%乙醇溶液脱色更为高效，可将脱色过程从数小时缩短至30分钟。
2. 用超纯水冲洗凝胶5分钟。
3. 使用凝胶成像系统在365 nm或302 nm通道下对凝胶进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LDS上样缓冲液（4X）	赛默飞世尔科技	NP0007	试剂
4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔	赛默飞世尔科技	NP0323BOX	预制胶
样品还原剂（10X）	赛默飞世尔科技	NP0004	试剂
MES SDS电泳缓冲液（20X）	赛默飞世尔科技	NP0002	试剂
小型凝胶电泳槽	赛默飞世尔科技	A25977	仪器设备
300 W 电源（230 VAC）	赛默飞世尔科技	PS0301	仪器设备
未染色蛋白质标准品	赛默飞世尔科技	26614	样本
硝酸银	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	试剂
乙醇	布拉格等人	42520J	试剂
乙酸	J.T. Baker	103201A	试剂
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	提供 18.2 MΩ厘米水柱
凝胶成像系统（c600 型号）	Azure Biosystems	-	仪器设备