幼虫 Drosophila 油细胞中的脂滴染色：利用基于BODIPY的染料在正常与应激条件下评估脂滴积累的技术

摘要

来源：Wei, C., 等 Oenocytes 的解剖与脂滴染色 果蝇 幼虫。 视频实验杂志 (2019).

本视频展示了利用亲脂性荧光染料 BODIPY 对果蝇（Drosophila）幼虫的类肝细胞——oenocytes 中的脂滴进行染色的方法。这些细胞可作为研究发育过程中以及应对饥饿等环境应激条件下脂质代谢的模型。

方案

1. 幼虫的饥饿处理

注意： 在正常饲养条件下，三龄幼虫的细胞中几乎检测不到或完全没有脂滴；但在饥饿等应激条件下，可在细胞中诱导产生大量大型脂滴。为了进一步验证该方法，有必要对幼虫进行预处理，以诱导细胞中脂滴的生成。本实验选用12小时、24小时和36小时的饥饿时间进程作为范例。特别地，短期饥饿（例如3小时）已足以在细胞中诱导出可检测的脂滴。饥饿持续时间可根据具体的实验目的和条件进行调整。

1. 制备饥饿处理和对照处理的实验腔室。
   1. 对于饥饿处理腔室：将适当大小的滤纸放入6 cm的培养皿中，并用移液器加入1 mL PBS至滤纸上。
   2. 对于对照处理腔室：在培养皿中加入5 mL 布卢明顿标准玉米粉培养基。
2. 使用解剖刀轻轻刮取含有仍埋在食物中的幼虫的上层培养基，并将其转移至盛有5 mL PBS的培养皿中。在PBS中轻轻搅动幼虫，以去除幼虫体表的食物残留，尽可能使其清洁。
3. 使用小号毛笔挑选40只大小相近的三龄幼虫，随机均分为两组，每组20只，分别放入饥饿处理组和对照组的腔室中。
4. 将实验腔室置于25 °C、60%湿度的培养箱中，分别进行12 h、24 h和36 h的处理。
   注意： 对于饥饿处理组中的幼虫，每12 h补充1 mL PBS，以防止幼虫脱水。

2. 气孔细胞的解剖

1. 使用小号画笔挑选适当年龄的幼虫（处理后 12 h、24 h 或 36 h），然后将其转移至盛有 5 mL 冰冷 PBS 的新培养皿中进行清洗。
   注意： 处理对照组幼虫时，需重复步骤 2.2，以去除任何食物污染。
2. 在解剖板中加入冰冷 PBS，并用镊子轻柔地将幼虫转移至解剖板中。将解剖板置于体视显微镜下，以进行后续解剖步骤。
   注意： 冰冷的温度有助于减缓幼虫的活动，便于解剖操作。
3. 将幼虫腹面朝上、背面朝下放置，并用镊子轻轻固定。通过前端咽部插入一枚解剖针，再通过后端气门插入另一枚解剖针，将幼虫固定在解剖板上。
   注意： 背侧最明显的识别特征是气管的背侧主干。
4. 使用 Vannas 弹簧剪从幼虫前端至后端沿纵轴方向剪开表皮。
5. 用镊子去除表皮内部的组织。
   注意： 在移除气管分支时需格外小心，避免损伤位于表皮内表面的脂细胞（oenocytes）。
6. 用镊子取出解剖针，将表皮转移至装有冰冷 PBS 的 1.5 mL 微量离心管中。
7. 按照上述步骤继续解剖其他幼虫。

3. 脂滴染色

1. 将分离的表皮组织置于固定液中，在室温（RT）条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。
   注意：固定液含有 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液。
2. 移除固定液后进行快速洗涤。快速洗涤操作如下：去除 PFA 后，向离心管中加入 1 mL 室温 PBS，轻轻重悬组织，随后弃去 PBS。
   注意：固定液中含有对人类健康有害的 PFA，必须将固定液作为危险废物妥善处理。
3. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟，以彻底清除残留的 PFA。
4. 将表皮组织与 BODIPY 493/503（1 µg/mL；参见材料表）在室温条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。
   注意：从本步骤开始，需用铝箔包裹微量离心管，以保护样品免受光照，减少可能的光漂白。
5. 移除 BODIPY 493/503 染色液，并用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟，以完全去除残留染料。

4. 封片与成像

1. 在干净的显微镜载玻片上滴加 6 µL 封片剂。
   注意：封片剂因其抗荧光淬灭特性，可用于延长检测时间。
2. 使用镊子夹取一片表皮，并用纸巾轻轻吸去残留的 PBS。
3. 将表皮放入封片剂中，调整其方向，使其含有脂细胞的内表面朝下，外表面朝上。
4. 轻轻将盖玻片覆盖在表皮上。
   注意：如有必要，可用纸巾吸去从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。为便于成像，可用镊子轻轻按压盖玻片，使在显微镜下观察时，脂细胞簇能够清晰地呈现在同一焦平面上。或者，也可沿中线将表皮切成两半，以避免完整表皮在封片时发生卷曲。
5. 在盖玻片四周涂抹透明指甲油进行封固。
6. 将载玻片放入避光样品盒中，在室温下静置，使指甲油干燥，此过程可能需要 5–10 分钟。
7. 进行显微分析。使用共聚焦显微镜（放大倍数 63×，优化 GFP 或 FITC 滤光片设置，激发波长 = 488 nm，发射波长 = 503 nm）采集图像，以获得背景低、信噪比高的清晰信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 离心管	Corning	430829	50 mL
6 cm 培养皿	Thermo Fisher	150326	6 cm
琼脂			用于果蝇食物
铝箔	N/A	N/A	防止样品见光
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	脂滴染色染料
共聚焦显微镜	Leica	Leica TSC SP5	共聚焦成像
玉米糖浆			用于果蝇食物
玉米粉			用于果蝇食物
盖玻片	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm，厚度 0.13–0.17
解剖针	N/A	N/A
解剖板	N/A	N/A
滤纸	N/A	N/A	直径：11 cm
固定缓冲液	N/A	N/A	含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS
镊子	Dumont	11252-30	#5
培养箱	Jiangnan	SPX-380	用于果蝇培养
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
载玻片	Citoglas	10127105P-G
封片介质	VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片 介质	H-1000	抗荧光淬灭封片介质
指甲油	PanEra	AAPR419	密封盖玻片
画笔	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na_{2} HPO_{4}，1.8 mM KH_{2} PO_{4}，pH 7.4）
旋转仪	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
剪刀	Smartdata Medical	SR81	Vannas 弹簧剪
大豆粉			用于果蝇食物
药匙	N/A	N/A
标准玉米粉培养基	N/A	N/A	根据布卢明顿标准 玉米粉培养基配方
体视显微镜	Leica	Leica S6E	用于组织解剖
擦拭纸	N/A	N/A
酵母			用于果蝇食物