hFTAA 染色法检测淀粉样沉积物：一种利用基于寡噻吩的荧光染料对组织切片中的淀粉样纤维进行荧光成像的可视化技术

摘要

来源：Nyström, S. 等，利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了一种使用发光共轭寡噻吩染料——七聚体甲酰基噻吩乙酸（hFTAA）对组织切片中的淀粉样蛋白进行荧光染色的技术。淀粉样蛋白是富含β-折叠结构的异常蛋白质聚集体。在组织样本中检测淀粉样蛋白有助于淀粉样蛋白相关疾病或蛋白质病变的诊断与治疗。

方案

1. LCO 染色液

注意：如果hFTAA是从商业供应商处购买的，请遵循供应商的说明，而非第1节。

1. 将冻干的 hFTAA 溶于 2 mM NaOH 中，配制成 1 mg/mL 的储存液。将储存液置于玻璃小瓶中，4 °C 保存。储存液可保存一年。
2. 染色当天，用磷酸盐缓冲液（PBS）将储存液按 1:10,000 的比例稀释，配制工作液。

2. 组织样本的制备

注意： 可使用 hFTAA 作为淀粉样蛋白标记物对多种组织类型进行成像。示例见图1。hFTAA 对聚集体构象敏感，因此染色应优先在未破坏的聚集体上进行，避免表位暴露。若组织固定程度尽可能低，则可获得最佳光谱质量。因此，推荐使用新鲜冷冻样本，并在染色时以乙醇轻柔固定。然而，即使使用e.g.甲醛固定的组织，也可检测到淀粉样蛋白沉积。hFTAA 通常能良好穿透组织。应根据预期的成像技术选择合适的样本厚度。

1. 若使用福尔马林固定、石蜡包埋的切片，需在二甲苯中脱蜡过夜。将切片依次浸入99%乙醇、70%乙醇和dH₂O中₂O 和 PBS 中各 10 分钟。让组织切片在室温条件下自然干燥。注意：二甲苯必须始终在化学通风橱中操作。二甲苯及其他有机溶剂有害。
   1. 室温下解冻冷冻切片。将组织切片置于10%福尔马林中固定过夜，随后依次浸入99%乙醇、70%乙醇和dH₂O中进行复水。₂O 和 PBS 中各孵育 10 分钟。让组织切片在室温条件下干燥。
2. 向组织切片上添加 hFTAA 工作液液滴（约 200 μL），以完全覆盖切片。液滴应依靠表面张力保持原位。室温孵育 30 分钟进行染色。
3. 用移液器加入500 μL PBS洗去染色液，然后将玻片浸入PBS溶液中浸泡10分钟。在室温条件下让组织切片自然干燥。
4. 使用荧光封片剂封片。封片剂需静置过夜。
   注意： hFTAA 染色可与其他染色方法联合使用，例如免疫荧光、细胞或细胞器特异性标记物 等等进行共染色时，先运行您选择的完整染色方案，最后加入 hFTAA 染色，从以下步骤开始 步骤 2.2参见 图2 例如，进行免疫荧光时，建议选择激发波长在640 nm或更高的二抗。在此波长范围内，hFTAA不发生吸收，因此无法被激发，也不会产生荧光。这可确保hFTAA与抗体之间无荧光串色现象。

结果

图1：不同组织类型及蛋白质聚集体的h-FTAA染色结果：(a) 肝脏中由角蛋白聚集体组成的Mallory-Denk小体（用DAPI复染），(b) 散发性包涵体肌炎（s-IBM）肌肉组织中p62阳性包涵体，(c) 人类胰腺中胰岛淀粉样多肽形成的淀粉样物质，(d) 人类肠道中免疫球蛋白轻链形成的淀粉样物质，(e) 小鼠脑组织中的羊瘙痒病（朊病毒），(f) 小鼠脑组织中的慢性消耗性疾病（朊病毒），(g) APP23转基因小鼠脑组织中的Aβ斑块，(h) ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
hFTAA/Amytracker545 	Ebba Biotech
Dako 荧光封片剂	Agilent Technologies 	GM304
Leica DM6000 	Leica
Lumen 200 	Prior
Spectraview 系统	 ASI 光谱成像