抗酒石酸酸性磷酸酶染色：一种 体外 检测含TRAP酶培养破骨细胞的技术

摘要

来源：Dai, Q., et al。一种基于 RANKL 的小鼠骨髓破骨细胞培养检测方法，用于研究 mTORC1 在破骨细胞形成中的作用。https://www.jove.com/v/56468 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了抗酒石酸酸性磷酸酶染色技术，用于检测破骨细胞内含TRAP的颗粒的存在。该技术可在破骨细胞的细胞质中形成品红色染料颗粒沉积，使其在倒置显微镜下可见。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备

1. 通过将 Raptor^fl/fl 小鼠与 Ctsk-cre 小鼠杂交，构建破骨细胞特异性 Raptor 基因敲除小鼠（Raptor^fl/fl; Ctsk-cre，以下简称 Rap^Ctsk）。在本研究中，使用 Raptor^fl/fl 小鼠作为野生型对照。
2. 准备一个装有冰的容器，用于保存分离的骨骼。
3. 准备培养基。
   1. 通过在最低必需培养基α（α-MEM）中添加1×谷氨酰胺、青霉素-链霉素和10%胎牛血清，制备α-MEM培养基。
   2. 制备骨髓巨噬细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中加入M-CSF至终浓度为20 ng/mL。
   3. 制备破骨细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中分别加入M-CSF和RANKL至终浓度均为20 ng/mL。
4. 在进行TRAP染色前，准备以下缓冲液。
   1. 制备固定液：将6.5 mL丙酮、2.5 mL柠檬酸溶液和0.8 mL 37%（体积/体积）甲醛溶液混合。
   2. 制备TRAP染色液。
      1. 将去离子水预热至37 °C。
      2. 取100 µL快红GBC盐溶液和100 µL亚硝酸钠溶液加入1.5 mL微量离心管中，轻轻颠倒混匀30秒，静置2分钟。
      3. 将9 mL去离子水预热至37 °C，加入1.4.2.2步骤中制备的重氮化快红GBC盐溶液200 µL、100 µL萘酚AS-BI磷酸盐溶液、400 µL醋酸盐溶液和200 µL酒石酸盐溶液。
      4. 将TRAP染色混合液置于37 °C水浴中保温。

2. 解剖（第-1天）

1. 使用 CO₂ 分别对 3 只一个月大的雌性 WT 和 Rap^Ctsk 小鼠实施安乐死。由经过培训的人员使用适当的设备进行 CO₂ 吸入操作。
2. 将 6 只小鼠浸入含有 100 mL 75% 乙醇（体积/体积）的烧杯中 5 分钟，以防止细菌污染，然后将其仰卧置于解剖板上。在胫骨远端垂直做切口，并用眼科剪沿后肢解剖皮肤。
3. 用剪刀剪断髋关节的关节韧带，将后肢与躯干分离。
4. 剪断膝关节的关节韧带，小心地将胫骨和股骨从膝关节分离。用剪刀轻轻去除软组织。
5. 将同一种基因型的一只小鼠的所有骨骼放入六孔板的每个孔中，每孔加入 2 mL α-MEM 并置于冰上。
   注意： 为保持细胞活力，骨骼在此条件下保存时间应少于 1 小时。

3. 分离（第-1天）

1. 在六孔板的一个孔中加入75%乙醇（3 mL），其余5个孔中各加入α-MEM培养基（3 mL）。
2. 将同一基因型的所有骨骼放入乙醇中洗涤15秒，随后用α-MEM培养基洗涤5次，每次10秒。
3. 用剪刀剪去骨骺，并将0.45 mm的注射针头插入骨髓腔，用α-MEM培养基冲洗骨髓，收集至50 mL离心管中。
4. 从骨的另一端采用相同方法冲洗骨髓腔。重复至少两次，彻底清洗骨髓腔，直至骨骼呈苍白色。
5. 将骨髓悬液在800 × g、4 °C条件下离心5分钟，获得细胞沉淀，吸除上清液。
6. 向离心管中加入3 mL红细胞裂解缓冲液，轻轻吹打重悬骨髓细胞。将离心管置于冰上孵育8分钟，以裂解红细胞。
7. 向离心管中加入6 mL α-MEM培养基以终止细胞裂解反应。在500 × g、4 °C条件下离心10分钟，吸除上清液。
8. 用3 mL α-MEM培养基重悬细胞，将细胞接种至六孔板中（通常每孔接种一只小鼠的细胞）。
9. 在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜。

4. 铺板（第0天）

1. 次日早晨，将上清液转移至15 mL离心管中，以收集未贴壁的细胞。
2. 在4 °C条件下，以800 × g离心5分钟，并吸除上清液。
3. 用4 mL α-MEM培养基重悬细胞沉淀。
4. 取20 µL细胞悬液，与20 µL台盼蓝混合。取10 µL混合液加入计数室，测定每毫升溶液中的细胞数量。
5. 加入适量α-MEM培养基，调整细胞浓度至500,000个细胞/mL。
6. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入500 µL和50 µL骨髓巨噬细胞诱导培养基。
7. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入500 µL和50 µL细胞悬液。
8. 在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育3天。

5. 分化（第3-7天）

1. 铺板后第三天，从96孔板的每个孔中收集50 µL培养基，并在-20 °C下冷冻，然后吸除残留培养基。
2. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入1 mL和100 µL破骨细胞诱导培养基。
3. 在37 °C下孵育2天。
4. 从每个孔中收集50 µL培养基，并吸除残留培养基。
5. 向每个孔中加入破骨细胞诱导培养基。
6. 在37 °C下孵育1天。
   注意： 此时应在倒置显微镜下观察到较大且多核的破骨细胞（图1A）。
7. 若未观察到破骨细胞，则更换破骨细胞诱导培养基，并每日观察，直至观察到破骨细胞为止。
8. 在破骨细胞形成后，从96孔板的每个孔中收集50 µL培养基。

6. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

注意： 6-7天后可能出现成熟的破骨细胞 体外 培养（步骤 4）。

1. 吸弃培养基，用 1× PBS 轻柔洗涤 3 次。
2. 每孔加入 100 µL 固定液，在室温下固定 96 孔板中各孔的细胞 30 秒。
3. 固定后，吸弃固定液，用预热至 37 °C 的去离子水轻柔洗涤 3 次，然后吸弃去离子水。
4. 每孔加入 100 µL TRAP 染色液，将 96 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，并避光。
5. 染色完成后，吸弃 TRAP 染色液，用去离子水轻柔洗涤 3 次。
6. 使用倒置显微镜在 40 倍放大倍数下观察破骨细胞。

结果

图 1：破骨细胞的代表性图像。 （A）第 6 天在明场下观察到的大型破骨细胞。红线标出了破骨细胞的边界。（B）一个典型的大型、多核、抗酒石酸酸性磷酸酶 TRAP 阳性（酒红色）的破骨细胞。黑色箭头指示了该多核破骨细胞中的两个细胞核。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Raptorfl/fl 小鼠	杰克逊实验室	13188
Ctsk-cre 小鼠			东京大学（日本东京）S. Kato 惠赠
α-MEM	康宁	10-022-CVR
谷氨酰胺	Gibico	25030081
青霉素-链霉素	Gibico	15140122
胎牛血清	BioInd	04-001-1A
重组小鼠 M-CSF 蛋白	R&D	Q3U4F9
重组小鼠 RANKL 蛋白	R&D	Q3TWY5
红细胞裂解缓冲液	Beyotime	C3702
台盼蓝	Sigma-Aldrich	302643
丙酮	上海化学有限公司
柠檬酸盐溶液	Sigma-Aldrich	915
甲醛溶液	上海化学有限公司
酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒	Sigma-Aldrich	387A-1KT
快速加恩特GBC基础溶液	Sigma-Aldrich	3872
亚硝酸钠溶液	Sigma-Aldrich	914
萘酚AS-BI磷酸盐溶液	Sigma-Aldrich	3871
乙酸盐溶液	Sigma-Aldrich	3863
酒石酸溶液	Sigma-Aldrich	3873
杜氏磷酸盐缓冲液	康宁	21-031-CVR
37% 甲醛	Xilong scientific
IX71	奥林巴斯
0.45-mm 注射器
剪刀
蚊子镊子