茜素红染色：一种用于可视化培养成骨细胞矿化作用的技术

摘要

来源：Kampleitner, C., 等. 用于骨再生的生物材料生物学相容性评价。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种染色技术，用于检测培养的原代成骨细胞中矿化或钙沉积程度，所用染料为茜素红（Alizarin Red）。

方案

1. 通过茜素红S（ARS）染色评估成骨细胞（OB）矿化

1. 将原代成骨细胞（OBs）接种至用作生物相容性支架的β-磷酸三钙（β-TCP）圆片中，并置于培养板内。
2. 在加入矿化培养基14天后，吸除含有原代成骨细胞的孔中培养液，用0.5 mL的1×PBS在室温下冲洗两次。吸除PBS后，加入0.5 mL的10%缓冲福尔马林溶液，在室温下固定细胞10分钟。
3. 使用一次性移液器吸除10%缓冲福尔马林溶液，并用0.5 mL超纯水洗涤两次。
4. 向固定的成骨细胞中加入0.25 mL溶于超纯水中的40 mM茜素红S（ARS）染色液（pH 4.2），将培养板置于摇床上，室温孵育10分钟，摇速为每分钟100次。
5. 使用一次性移液器吸除染色液，加入1 mL超纯水冲洗。重复此步骤5–10次，以去除非特异性染色。
   注意：冲洗液应无颜色。
6. 吸除超纯水，加入1 mL冷PBS。将培养板置于摇床上，室温孵育10分钟，摇速为每分钟100次。
7. 吸除PBS，将染色后的β-TCP圆片转移至新孔中，使用平板扫描仪扫描培养板以记录矿化情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
β-磷酸三钙圆盘（β-TCP，14 mm）			将圆盘在马弗炉中于1150 °C下烧结。详细的制备方法见Zimmer等（doi: 10.1002/jbm.a.34639）。样品在用于细胞培养前需进行紫外照射（每侧15分钟）。
Orthovita Vitoss泡沫（β-TCP/C泡沫）	Orthovita	2102-1405
茜素红S	Sigma-Aldrich	A5533
中性缓冲福尔马林溶液 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
成骨矿化培养基（MM）			α-MEM + 10% 热灭活FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 50 µg/mL 抗坏血酸 + 5 mM β-甘油磷酸钠
1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
超纯水：无热原细胞培养用水	VWR	L0970-500
洗涤缓冲液			向1× PBS中加入 0.05% Tween20。
24孔悬浮培养板	Greiner bio-one	662102
平板扫描仪：Epson Perfection 1200 Photo	Epson
一次性移液管：血清移液管	Greiner bio-one	612301
蒸馏水	Carl Roth	3478.4
一次性移液管：血清移液管	Greiner bio-one	612301