聚丙烯酰胺凝胶中硫酸化糖胺聚糖的银染：一种用于可视化硫酸化糖胺聚糖的染色方法

摘要

来源：LaRiviere, W. B.，等。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测糖胺聚糖。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了一种联合使用阿尔新蓝和银染法对硫酸化糖胺聚糖寡糖片段进行染色的实验步骤。这种联合染色技术可显著增强聚丙烯酰胺凝胶中不同长度糖胺聚糖聚合物条带的显色效果。

方案

1. 银染实验方案

1. 提前准备好银染所需的所有溶液（表1）。
   注意：在凝胶完成染色、显影并放入终止液之前，请勿直接用手接触PAGE凝胶。应使用洁净的塑料或玻璃工具操作凝胶。直接用手接触会导致指纹污染及其他可见的人工假象。
2. 电泳结束后，将凝胶夹板拆开，并将凝胶转移至一个洁净的中等偏大容器中，容器内盛有去离子过滤水。
   注意：为避免直接接触凝胶，可在水中使用移液器吸头或其他塑料工具轻轻将凝胶从夹板上剥离。凝胶可能较脆弱，请小心操作。
   1. 弃去水溶液。将凝胶置于阿尔新蓝染色液中染色5分钟。
   2. 弃去阿尔新蓝染色液。用去离子过滤水快速冲洗/洗涤2–3次，直至大部分阿尔新蓝染色液被去除。
   3. 将凝胶置于去离子过滤水中，在摇床中过夜脱色。确保使用足量的去离子过滤水，以保证残留染料在过夜过程中被彻底洗脱。
   4. 用50%甲醇洗涤凝胶（共40分钟，期间更换溶液2–3次）。
   5. 用去离子过滤水洗涤凝胶30分钟。弃去水后重复此步骤3次，总计洗涤2小时，每次均更换新水。
   6. 在干净的新容器中，将凝胶置于硝酸银染色液中染色30分钟。
   7. 用去离子过滤水快速冲洗/洗涤2–3次，彻底去除硝酸银染色液。
   8. 用去离子过滤水洗涤30分钟。弃去水后重复2次，总计洗涤90分钟，每次均更换水浴液。
   9. 弃去水，加入显影液。
   10. 加入显影液后，仔细观察凝胶，注意蛋白条带的出现。根据染色质量和上样量的不同，显影时间可能从几秒到数分钟不等。
   11. 一旦观察到理想的条带，立即弃去显影液，并用终止液短暂洗涤。
   12. 弃去终止液洗涤液，更换为新鲜的终止液。在摇床或振荡器上浸泡1小时。
   13. 在去离子过滤水中洗涤过夜（但凝胶在终止液洗涤后可立即进行成像）。

表1： 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离糖胺聚糖的银染所需溶液。 所有溶液在使用前必须过滤（0.22 μm）。

注意： 所有溶液在使用前必须经过滤（0.22 μm）。
溶液	配方	成分	备注
阿尔新蓝染色液（500 mL）	阿尔新蓝 8GX 粉末	2.5 g	目标浓度：0.5% w/v
	2% v/v 冰醋酸	500 mL
银染液（200 mL）	去离子水	192.7 mL	需新鲜配制染色液，一周内使用完毕。
	7.6 M 氢氧化钠	2 mL	配制方法：将 3.04 g 氢氧化钠颗粒加入 10 mL 水中
	氢氧化铵	3.3 mL
	4 M 硝酸银溶液	2 mL	配制方法：将 3.397 g 硝酸银加入 5 mL 水中。搅拌下逐滴加入，避免产生沉淀。
显色液（501 mL）	去离子水	500 mL	显色液必须新鲜配制，并在 24 小时内使用。
	2.5% w/v 柠檬酸	1 mL	配制方法：将 100 mg 柠檬酸加入 4 mL 去离子水中。柠檬酸溶液必须新鲜配制。
	甲醛	250 μL
终止液（500 mL）	去离子水	300 mL
	冰醋酸	20 mL
	甲醇	90 mL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alcian Blue 8GX（固体）	ThermoFisher Scientific	AC400460100
氢氧化铵（液体）	ThermoFisher Scientific	A669S-500	符合ACS认证标准
Barnstead GenPure Pro 水纯化系统	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	任何去离子/水纯化系统均可作为替代
冰乙酸（液体）	ThermoFisher Scientific	A35-500	符合ACS认证标准
甲醇（液体）	ThermoFisher Scientific	A412-500	符合ACS认证标准
硝酸银（固体）	ThermoFisher Scientific	S181-25	符合ACS认证标准
氢氧化钠（固体）	ThermoFisher Scientific	S392-212
真空滤器单元，一次性使用，PES膜，孔径0.22 µm，体积500 mL	ThermoFisher Scientific	569-0020	其他体积规格和滤膜材料亦可接受
Molecular Imager Gel Doc XR 成像系统	Bio-Rad	170-8170	任何性能相当的凝胶成像系统均可作为替代