吉姆萨染色法用于克隆形成实验：一种体外评估间充质干细胞增殖能力的染色方法

摘要

来源：Schlaefli, P. 等. 一种通过酶法从凝结的骨髓样本中回收间充质干细胞的方法. 视觉化实验杂志 (2015)

在本视频中，我们演示了吉姆萨染色法，用于评估间充质干细胞形成活细胞集落的增殖潜能。吉姆萨染料是一种中性染料，主要由伊红和天青组成，根据细胞组分所带电荷的不同，对细胞各部分具有选择性亲和力。

方案

1. 扩增细胞培养和集落形成单位（CFU）平板的接种

1. 将细胞（包括红细胞和单个核细胞）重悬于50 ml基础培养基中：即添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2.5 mg/ml两性霉素B的α-MEM培养基。用台盼蓝溶液按1:10稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
2. 以5 × 10⁷ 个细胞/cm²的密度将细胞接种至细胞培养瓶中，并在37 °C、湿度饱和的培养箱中培养。如有条件，可采用低氧环境（5%氧气）。对于CFU检测对照组，将10⁹个细胞接种于直径为10 cm的细胞培养皿中。
3. 培养3天后，间充质干细胞已贴附于培养皿表面，而其他细胞仍处于悬浮状态。此时更换为添加了5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的基础培养基。CFU检测对照组的培养皿同样进行相同处理。
4. 继续培养至总共2周时间，每周更换培养基三次。若细胞融合度超过80%，则用胰酶消化进行传代。CFU检测对照组同样更换培养基，但在两周内不进行细胞传代。

2. CFU 测定的吉姆萨染色

1. 每皿准备 10 ml 吉姆萨染液：将储备液（7.6 g/L 吉姆萨溶于甘油:甲醇中）用无菌水按 1:10 比例稀释（每次均需新鲜配制工作液）。
2. 移除细胞培养皿中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞。向培养皿中加液时需格外小心，避免冲走细胞。
3. 用纯甲醇在室温下固定细胞 5 分钟，弃去甲醇。加入吉姆萨染液，在 37 °C 湿润培养箱中孵育 60 分钟。
4. 用 PBS 洗涤两次。将培养皿底部朝上，在纸巾上自然晾干。手动计数克隆集落，最好使用记号笔在培养皿背面标记以便计数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基础培养基成分
青霉素-链霉素溶液（100倍浓度）	Gibco	15140122
人碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
含核苷酸和稳定型谷氨酰胺的MEM α培养基	Amimed	1-23S50-I
经热灭活处理的胎牛血清	Amimed	2-01F36-I
两性霉素B	Applichem	A1907
通用试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Applichem	964.91
吉姆萨染液	Applichem	A0885
耗材
Primaria 细胞培养皿	Falcon	353803
细胞培养瓶 - T300 型培养瓶	TPP	90301
仪器设备
5 ml 移液管（Stripettes 系列）	Corning	4487-200ea
Heracell 240 恒温高湿培养箱	Thermo scientific	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R 离心机	Thermo scientific	75004331