使用阿尔新蓝染色法可视化蛋白聚糖：一种检测间充质干细胞分化软骨细胞培养中蛋白聚糖的技术 体外

摘要

来源：Schlaefli, P. 等，一种从凝结的骨髓样本中回收间充质干细胞的酶法，J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了使用阿利新蓝染色法检测功能性软骨细胞分泌的蛋白聚糖。该方法有助于判断间充质干细胞在体外分化为成熟软骨细胞是否成功。

方案

注意：在获得犬主同意后，从犬的髂嵴采集骨髓穿刺液。采集后立即在手术室中加入 15 ml 3.8% 枸橼酸钠，以抗凝约 10 ml 的犬骨髓穿刺液。样本于采集当日转移至实验室环境中进行处理。

1. 尿激酶的制备（之前）^st 使用

1. 根据制造商说明书，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新溶解尿激酶：用10 ml注射器向带隔膜入口的瓶中加入10 ml PBS，通过轻轻旋转溶解干粉，得到每毫升含50,000注射单位（U）的溶液。
2. 将500 μl分装至无菌离心管中（每管含25,000 U）。将分装样品于-20 °C保存，可在至少6个月内根据需要使用。

2. 准备步骤（每次骨髓处理前）

1. 每个凝块化的骨髓穿刺液样品解冻一份尿激酶（25,000 U）（已成功使用单份25,000 U的尿激酶处理体积达25 ml的穿刺液）。
2. 将水浴箱或摇床培养箱预热至37 °C。

3. 血凝块的酶消化

1. 所有操作均应在层流生物安全柜中进行，以避免处理骨髓样本时发生微生物污染。当处理可能具有传染性的人体材料时，建议佩戴防护手套并谨慎操作。
2. 将一个100 μm细胞筛置于无菌50 ml离心管上方。小心地将骨髓穿刺液通过细胞筛过滤，倾斜筛子或移动凝块组织以促进过滤。使用无菌移液器吸头可改善滤网中的液体流过效果。
   注意：避免对凝块进行任何稀释，例如，不要用PBS冲洗凝块。尿激酶的作用是间接的，其有效消化需要活检样本中的血清成分（即，纤溶酶原）。在继续处理凝块组织的同时，滤液可在室温下保存，待后续在步骤3.6中使用。
3. 使用无菌镊子将骨髓凝块转移至一个空的细胞培养皿中。用无菌手术刀将组织碎片切成约2 mm³大小的小块。
4. 使用无菌镊子将凝块小块转移至一个50 ml反应管中。确保切碎的凝块呈湿润状态。若其显得干燥，可使用步骤3.1中获得的部分滤液进行润湿。
5. 用5 ml移液器上下吹打混悬液5次以进行组织分散。向样品中加入一份尿激酶。在37 °C水浴或轻度振荡培养箱中孵育30分钟。
6. 用5 ml移液器上下吹打混悬液5次。此步骤应在生物安全柜中进行。再次于37 °C孵育30分钟。孵育结束后，再用5 ml移液器吹打5次。通过新的100 μm细胞筛过滤，与步骤3.2所得滤液合并。
7. 将细胞悬液在常温下以500 × g离心10分钟。弃去上清液。根据下文所述方法或您实验室用于间充质干细胞扩增培养的标准操作程序，用培养基重悬细胞沉淀。

4. 扩增细胞培养和集落形成单位（CFU）平板的接种

1. 将细胞（包括红细胞和单个核细胞）重悬于50 ml基础培养基中：即添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2.5 mg/ml两性霉素B的α-MEM培养基。用台盼蓝溶液按1:10稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
2. 以5 × 10⁷ 个细胞/cm² 的密度将细胞接种至细胞培养瓶中，并在37 °C、湿度控制的培养箱中培养。如有条件，可采用低氧环境（5%氧气）。对于集落形成单位（CFU）检测对照组，将10⁹ 个细胞接种至直径为10 cm的细胞培养皿中。
3. 培养3天后，间充质干细胞会贴附于培养皿表面，而其他细胞仍处于悬浮状态。此时更换培养基，使用添加了5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的基础培养基。对于CFU检测对照组，同样处理培养皿中的细胞。
4. 继续培养共计2周，每周换液三次。若细胞融合度超过80%，则通过胰酶消化进行传代。对于CFU检测对照组，同样更换培养基，但在两周内不进行细胞传代。

5. 间充质干细胞分化

1. 犬源MSCs的分化
   注意：通过使用适当的培养基刺激四周，将犬源MSCs分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞谱系。
2. 软骨分化
   1. 从由冻干I型胶原构成的海绵状医疗器械上切割出边长为3 mm的立方体，并用作支持细胞生长的支架材料。
   2. 以4 × 10⁶ 个细胞/ml的浓度（约每立方体70,000个细胞）将MSCs接种至立方体顶部。
   3. 在加入培养基前，让细胞在立方体上贴附30分钟。
   4. 将MSC-胶原复合物维持在软骨诱导培养基中，该培养基由DMEM/F12 + GlutaMAX、2.5% FBS、100单位/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、2.5 μg/ml两性霉素B、40 ng/ml地塞米松、50 μg/ml抗坏血酸磷酸酯、50 μg/ml L-脯氨酸、1×胰岛素-转铁蛋白-硒X和10 ng/ml转化生长因子-β1组成。
   5. 采用阿利新蓝染色法对切片中蛋白聚糖的积累情况进行可视化检测。简言之，用含0.4%阿利新蓝的溶液（溶解于0.01% H₂SO₄和0.5 M盐酸胍中）对切片过夜染色；随后用含40% DMSO和0.05 M MgCl₂的溶液洗涤切片30分钟。细胞核复染使用快红染色法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基础培养基成分
PenStrep 100X	Gibco	15140122
人碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
含核苷酸和稳定型谷氨酰胺的MEM Alpha培养基	Amimed	1-23S50-I
热灭活胎牛血清	Amimed	2-01F36-I
两性霉素B	Applichem	A1907
成脂诱导培养基成分
含GlutaMAX的DMEM-HAM F12培养基	Amimed	1-26F09-I
成软骨诱导培养基成分
Biopad - 海绵状医用装置	Euroresearch
L-脯氨酸	Sigma	P5607
胰岛素-转铁蛋白-硒X	Gibco	51500056
人转化生长因子-β1	Peprotech	100-21
阿利新蓝8GX	Sigma	A3157
核固红	Sigma	N8002
通用型三水合柠檬酸钠	Applichem	A3901
PBS	Applichem	964.91
硫酸 (H2SO4)	Applichem	A0655
二甲基亚砜 (DMSO)	Applichem	A1584
氯化镁 (MgCl2)	Applichem	A3618
盐酸胍	Applichem	A1499
耗材
50 ml 离心管	Axygen	SCT-50ML-25-S
10 ml 注射器	Braun	4606108V
无菌针头 (22G)	Braun	4657624
1.7 ml 微量离心管	Brunschwig	MCT-175-C
100 μm 细胞滤网	Falcon	6.05935
无菌镊子	Bastos Viegas, SA	489-001
无菌手术刀	Braun	5518059
Primaria 细胞培养皿	Falcon	353803
C-Chip 改良型血球计数板	Bioswisstech	505050
细胞培养瓶 - Flask T300	TPP	90301
设备
II级微生物生物安全柜	Skan	82011500
水浴锅	Memmert	1305.0377
5ml 移液管（血清学移液管）	Corning	4487-200ea
显微镜	Olympus	CKX41
加湿培养箱 Heracells 240	Thermo scientific	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo scientific	75004331