苏丹IV染色：一种用于染色收获的小鼠主动脉弓中富含脂质的动脉粥样硬化斑块的方法 关键词：苏丹IV染色，动脉粥样硬化斑块，小鼠主动脉弓，脂质染色，组织学染色

摘要

来源：Centa, M.，等。小鼠动脉粥样硬化定量分析。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了使用苏丹IV染色法对获取的小鼠主动脉弓中的脂肪沉积进行染色，以观察动脉粥样硬化斑块并确定动脉粥样硬化的程度。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 主动脉弓和无名动脉的正面分析

1. 准备用于主动脉弓内表面分析的固定垫。将一段石蜡膜折叠八次，制成一个25 mm × 25 mm的平整表面。用黑色电工绝缘胶带包裹其外层，为主动脉提供深色背景。在固定垫背面贴上标签，并使用铅笔写上小鼠编号（普通墨水笔的字迹会在染色过程中消失）。
2. 将主动脉弓转移至固定垫上，并在其上方滴加一滴PBS。在体视显微镜下开始清除残留的外膜周围脂肪组织。
   1. 使用Vannas剪刀和Dumont镊子轻轻剥离所有周围的脂肪组织，避免操作或损伤主动脉。苏丹IV可使脂肪组织明显着色，因此在此步骤中彻底清除所有脂肪组织至关重要。
      注意： 始终保持主动脉湿润，必要时可补充PBS。
3. 沿冠状面切开主动脉，将Vannas剪刀插入主动脉腔内以暴露内膜表面。从升主动脉弓的外侧曲面远端开始切开，并继续切开包括头臂干在内的分支血管，保留降主动脉胸段的背侧部分。
   1. 切开主动脉的小弯侧，并将其展开以充分暴露内膜表面。
      注意： 此步骤需要精细的操作技巧，需经过一定练习方可掌握。
4. 使用微型昆虫针的钝端将展开的主动脉弓固定在固定垫上。使用微型Castroviejo持针器放置固定针，针插入后轻轻向外弯曲，避免接触标本。将主动脉平整固定于垫上，切勿拉伸标本。将固定好的主动脉弓朝下存放于盛有PBS的培养皿中，4 °C保存。
   注意： 此处可暂停实验流程。
5. 配制苏丹IV工作液。取1 g苏丹IV粉末、100 mL 70%乙醇和100 mL丙酮，混匀后置于避光瓶中，轻轻搅拌10分钟。溶液无需过滤，若避光室温保存，可使用数月。若染色效果不理想，可重新配制溶液并再次染色。
   注意： 丙酮为易燃液体，可能引起严重眼刺激。储存时应置于通风良好处，操作时采取预防措施。
6. 在实验台上准备五个培养皿：分别盛有70%乙醇、苏丹IV工作液、两份80%乙醇以及PBS。
   1. 首先将固定垫放入盛有70%乙醇的第一个培养皿中，主动脉弓朝下，冲洗5分钟。随后将标本转移至苏丹IV工作液中，染色7分钟。
   2. 接着依次在80%乙醇中漂洗两次，每次3分钟，以脱去正常内膜表面的染料。脱色时间可根据实际情况调整以优化结果。最后用PBS漂洗，然后将标本放回原始培养皿中。
7. 使用连接数字相机的体视显微镜（放大倍数10倍）拍摄显微图像。将标本浸没于PBS中进行拍照，使用小型金属重物（20 mm × 10 mm × 5 mm）将固定垫压在培养皿底部以保持稳定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黑色电工绝缘胶带（50 mm 宽）	任意专业零售商		用于制作主动脉弓的固定床。
解剖剪刀（10 cm，直型）	World Precision Instruments	14393	用于器官的一般解剖。
Dumont 镊子 #5（11 cm，直型）	World Precision Instruments	500341	用于主动脉的显微解剖。
70% 乙醇（v/v）	VWR Chemicals	83801.29	高度易燃液体和蒸气，应储存于通风良好的地方，并保持阴凉。
无水乙醇 ≥99.8%	VWR Chemicals	20821.31	高度易燃液体和蒸气，应储存于通风良好的地方，并保持阴凉。
4% 稳定化缓冲甲醛（pH 7.0）	VWR Chemicals	9713.1	吸入、皮肤接触或吞咽有害。
异丙醇	Merck	1096341011	易燃液体，可引起严重眼刺激，可能引起嗜睡或头晕。
微型 Castroviejo 针持（9 cm，直型）	World Precision Instruments	503376	用于固定主动脉弓。
Minutien 昆虫针，0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10	用于固定主动脉弓。
Parafilm M	Bemis	PM992	石蜡膜，用于制作主动脉弓的固定床。
磷酸盐缓冲液（PBS）	-	-	小鼠灌注需使用无菌且无 RNase 的溶液
体视显微镜	Leica Microsystems	MZ6	用于解剖和表面成像记录
苏丹 IV	Sigma-Aldrich	S4261	未被归类为危险物质或混合物。
Vannas 剪刀（8 cm，直型）	World Precision Instruments	503378	用于主动脉的显微解剖。