Wiesner染色法用于观察木质素：一种对拟南芥（Arabidopsis thaliana）茎中木质素沉积进行染色的技术

摘要

来源：Pradhan Mitra, P. 等人 组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分 视频实验杂志 (2014).

在本视频中，我们介绍用于染色植物特化细胞中木质素的维斯纳染色法。该染色技术有助于观察拟南芥（Arabidopsis thaliana）茎中木质化的细胞壁，并可帮助定量分析不同类型细胞细胞壁中的木质化程度。

方案

1. 茎部包埋

1. 制备7%的琼脂糖水溶液（7 g电泳级琼脂ose溶于100 ml蒸馏水中）。通过高压灭菌20分钟或在最低功率下微波加热20分钟以溶解琼脂糖。例如，1250瓦微波功率的10%强度。
2. 使用塑料离心管制备用于包埋茎段的自制模具。
   1. 使用剃刀刀片切下2 ml螺口离心管（A部分）的圆锥形底部。用注射器针头在管盖上穿刺一个孔，孔径略大于待包埋茎段的直径。接着，从0.6 ml离心管底部切下0.5 cm（B部分）。
   2. 将0.6 ml微量离心管预先切去的0.5 cm管段插入已预切的2 ml微量离心管中，用Parafilm密封两部分接合处图1).
      注意： 将试管底部切开，以便在琼脂糖凝固后取出包埋的样本。管盖上的孔有助于在将茎段包埋于琼脂糖中时固定茎段位置。模具用于承载琼脂糖并确保包埋时茎段保持垂直。Parafilm 将固定 A 和 B 两部分，直至琼脂糖凝固且茎段完成包埋。
   3. 使用剃须刀片从目标区域切取一段茎组织，（例如 第一个茎节间的中部
      注意： 理想情况下，应在包埋前立即切割茎段，以避免脱水造成的破坏。 Alternatively，可将茎段暂时存放于含有经水润湿的滤纸的培养皿中。该培养皿可置于冰上，直至准备进行包埋，以防止组织脱水和变形。若将茎段在无高湿度条件下存放超过30分钟，将导致茎段干燥。
3. 在微波炉中以低功率融化琼脂糖。
   注意： 装有琼脂糖的瓶子可能很烫，请使用手套拿起瓶子。将熔化的琼脂糖在室温（20 °C 至 25 °C 之间）放置，冷却至约 50 °C。
4. 用移液器缓慢将5 ml琼脂糖加入预制的塑料模具中，以填满小瓶。
   注意： 确保模具中无气泡。气泡会导致琼脂糖模具出现空隙，无法完全覆盖茎段样本，最终造成样本切片不均匀。
   1. 让琼脂糖冷却 30 至 60 秒，直至呈半固态。用一根小牙签测试，确保牙签能够刺入并在琼脂糖中直立不倒，但不会漂浮。
      注意： 如果在琼脂糖仍处于高温状态时插入茎段，会导致茎段收缩，从而损伤样品并破坏细胞形态。
   2. 将茎放入此装有琼脂糖的小瓶中。确保茎保持直立。以适当方式放置带孔的瓶盖，使茎的顶端被瓶盖固定。不要旋紧螺旋瓶盖。有时可在同一小瓶中包埋多个同类型的茎；但在此情况下，请勿使用瓶盖。
      注意： 如果旋转旋紧盖，茎部会发生扭曲。
5. 将小瓶置于室温或4 °C下放置10–30分钟，直至凝固。
6. 轻轻将模具从管中滑出以取出模具。打开Parafilm。用拇指轻推模具B部分的底部，使凝固的琼脂糖从A部分脱出，置于玻璃显微镜载片上。
7. 将包埋在琼脂糖中的茎切成三段，每段长约1.2 cm。切除未被琼脂糖包埋的茎段部分并弃去。
   1. 将含有茎段的琼脂糖块置于避光盒中的密封2 ml微量离心管内，于4 °C保存，待切片时使用。或者，可将离心管在4 °C下最多保存一周。
      注意： 可以进行储存，但实验人员需注意，包埋的茎仍处于存活状态，根据具体实验情况，可能会引入潜在的人为假象。

2. 茎部切片

注意：请仔细阅读振动切片机使用手册，并遵守所有安全操作规程。

1. 确保样品载片清洁且完全干燥（无任何固体或液体残留）。使用刀片刮除先前实验留下的残余胶水，并用水清洗，然后用纸巾擦干。
   注意：此步骤可确保粘合剂有效发挥作用并与琼脂糖样品牢固结合。若此步骤操作不当，样品可能无法牢固粘附于载片上，导致切片过程中样品从载片脱落。
   1. 使用柔软的纸巾擦去含样品的琼脂糖块表面的水分。
   2. 在样品载片上滴加少量组织粘合剂，用粘合剂瓶的瓶尖将粘合剂涂抹至载片中央区域。迅速将琼脂糖块放置于载片上，使样品方向与载片垂直或平行，分别用于获取横切面或纵切面。在室温或4 °C条件下静置10–30分钟，使粘合剂将样品固定于载片上。注意：此步骤对时间敏感。
2. 将样品载片固定在缓冲槽或缓冲托盘中，使琼脂糖块与刀片保持平行。向缓冲槽中加入室温蒸馏水，直至样品完全浸没。
3. 将刀片剪成两半，再用坚固的剪刀修剪两端，确保刀片保持完全平整。将其中一半预切割的刀片安装至刀架上。
   1. 将刀架角度设为84°，速度设为0.90 mm/sec（振动切片机第8档），频率设为50 Hz（振动切片机第5档），切取厚度为100 µm的切片。使用连续切片模式。注意：选择此厚度是为了确保组织能够耐受某些染色方案中使用的酸性和碱性处理。设定切片窗口，并以连续模式运行振动切片机15–20分钟，以完成对约1.2 cm大小的琼脂糖块的切片。
4. 在切片过程中，使用一次性塑料移液器从缓冲槽中收集切片。或者，可先将切片转移至玻璃烧杯，再转移至透明的培养皿中。将少量切片转移至2.0 ml微量离心管中。注意：切片通常从培养皿中收集，因其在透明背景下更易观察，同时可使缓冲槽为下一个样品的切片做好准备。
5. 切片可暂时存放于50 ml离心管中，或收集后置于1.5至2 ml微量离心管中，在4 °C条件下保存30至60分钟。
   注意：长时间存放将导致图像质量下降。

3. 间苯三酚-盐酸（Wiesner）染色

1. 将0.3 g间苯三酚溶解于10 ml无水乙醇中，配制3%间苯三酚溶液。取一份体积的浓盐酸（37 N）与两份体积的3%间苯三酚乙醇溶液混合，所得溶液即为间苯三酚盐酸（Ph-HCl）或Wiesner染液。
   注意：该溶液需在染色当天新鲜配制，不可储存，因溶液会随时间降解而导致染色效果失效。
   注意：盐酸具有强腐蚀性，操作Ph-HCl染液时务必格外小心。
2. 将茎段转移至2.0 ml的微量离心管中。向含有茎段的管中加入1 ml Ph-HCl溶液，并立即盖紧管盖，因为Ph-HCl染液中的盐酸具有强腐蚀性。轻轻晃动管子，确保所有茎段均被染色。此步骤的替代方法是保持管盖打开，以便用移液器反复吹吸Ph-HCl溶液，最好避免扰动茎段。
   注意：操作时切勿将茎段吸入移液器吸头内，以免损伤这些茎段。
   1. 使用1 ml移液器，移液吸头应剪切适当，以便茎段可轻松移出而不受损伤。轻柔地将茎段移入吸头，并转移至显微镜载玻片上。盖上盖玻片，在明场照明下观察茎段。（图2）
      注意： Ph-HCl溶液在5–10分钟内会干燥，导致样本质量下降。因此，成像必须在此时间段内完成。

结果

图 1. 用于包埋茎段的自制模具。 左侧：2 ml 螺口微量离心管的上部（A 部分）和 0.6 ml 微量离心管的底部（B 部分）。右侧：Parafilm 膜将 A 和 B 两部分固定在一起，形成最终的模具。

图2. 桂皮酸-HC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖  	EMD	MERC2125	 CAS 编号: 9012-36-6
间苯三酚  	Sigma	P 3502	 1,3,5-三羟基苯 [CAS 编号: 108-73-6]
盐酸  	 EMD	HX0603-75	CAS 编号: 7647-01-0
190 证明乙醇   	KOPTEC	V1401	CAS 编号: 64-17-5
振动切片机  	Leica 	Leica 振动刀片切片机 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ products/sectioning/vibratingblade-microtomes/details/product/ leica-vt1000-s/
剃刀  	American Safety Razor 公司	 货号 # 60-0139-0000	不锈钢双刃刀片（Personna Super）
螺帽微量离心管（2 ml）  	VWR	16466-044
微量离心管（0.6 ml）  	Axygen Scientific	 MCT-060-C
组织粘合剂  	Ted Pella 公司	10033	4 °C 或 -20 °C 下保存 3 个月或更长时间
无机械快门的 CCD 芯片相机 	Hamamatsu 	C4742-95
相机软件  	分子设备公司	MetaMorph 版本 7.7.0.0
图像分析  	Adobe	Photoshop CS4
方形显微盖玻片，1 号 	VWR	 48366-067	 22 x 22 mm (7/8 x 7/8") — 盖玻片具有抗腐蚀性
磨砂显微载玻片，1 mm   	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm