Calcofluor White 染色：一种通过紫外诱导荧光可视化双子叶植物茎切片细胞壁中纤维素沉积的简易方法

摘要

来源：Pradhan M. 等. 组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分 视频实验杂志 (2014)

在本视频中，我们介绍了一种染色方法，利用能够特异性结合β-连接葡聚糖并在紫外光下产生荧光的棉酚白（calcofluor white），对双子叶植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞壁中的纤维素沉积进行可视化观察。

方案

1. 茎段包埋

1. 制备7%的琼脂糖水溶液（7 g电泳级琼脂ose溶于100 ml蒸馏水中）。通过高压灭菌20分钟或在最低功率下微波加热20分钟以溶解琼脂糖。例如，1250瓦微波的10%强度）。
2. 使用塑料离心管自制模具，用于包埋茎段。
   1. 使用剃须刀片切下2 ml螺口离心管（A部分）的圆锥形底部。用注射器针头在管盖上穿一个孔，孔径略大于待包埋茎段的直径。接着，从0.6 ml离心管底部切下0.5 cm（B部分）。
   2. 将0.6 ml微量离心管底部已切去的0.5 cm部分插入预先切好的2 ml微量离心管中，用Parafilm密封两部分接合处。图1).
      注意将试管底部剪掉，以便在琼脂糖凝固后取出包埋的样品。管盖上的孔有助于在将茎段包埋于琼脂糖时固定茎段位置。模具用于承载琼脂糖，并在包埋过程中保持茎段直立。Parafilm 将固定 A 和 B 两部分，直至琼脂糖凝固且茎段完全包埋。
   3. 使用剃须刀片从目标区域切取一段茎段，（例如 第一个茎节间的中部
      注意理想情况下，应在包埋前立即切割茎段，以避免脱水造成的破坏。 Alternatively，可将茎段暂时存放于含有经水润湿的滤纸的培养皿中。该培养皿可置于冰上，直至准备进行包埋，以防止组织脱水和变形。若将茎段在无高湿度条件下存放超过30 min，会导致茎段干燥。
3. 在微波炉中以低功率融化琼脂糖。
   警告：含有琼脂糖的瓶子可能很烫。请使用手套拿起瓶子。将熔化的琼脂糖在室温（20 °C 至 25 °C 之间）放置，冷却至约 50 °C。
4. 用移液器缓慢将5 ml琼脂糖加入预制的塑料模具中，以填满小瓶。
   注意确保模具中无气泡。气泡会导致琼脂糖模具出现空隙，无法完全包埋茎段样本，最终造成样本切片厚度不均。
   1. 让琼脂糖冷却30至60秒，使其变为半固体状态。用一根小木签进行测试，确保木签能够刺入琼脂糖并直立其中，但不会漂浮。
      注意如果在琼脂糖仍处于高温状态时插入茎段，会导致茎部收缩，从而损伤样品并破坏细胞形态。
   2. 将茎放入此装有琼脂糖的小瓶中，确保茎保持直立。将带孔的瓶盖放置妥当，使茎的顶端被瓶盖固定。不要旋紧螺旋瓶盖。有时可在同一小瓶中包埋多个同类型的茎；但在此情况下，请勿使用瓶盖。
      注意：如果旋转旋紧盖，茎部会发生扭曲。
5. 将小瓶置于室温或4 °C条件下10-30分钟，直至凝固。
6. 轻轻将模具从管中滑出以取出模具。打开封口膜。用拇指轻推模具B部分的底部，使凝固的琼脂糖从A部分脱出，置于玻璃显微镜载片上。
7. 将包埋在琼脂糖中的茎切成三段，每段长约1.2 cm。切除未被琼脂糖包埋的茎段部分并弃去。
   1. 将含有茎段的琼脂糖块置于避光盒中的密封2 ml微量离心管内，于4 °C保存，待切片时使用。或者，可将离心管在4 °C下最多保存一周。
      注意：可以储存，但实验人员需注意，包埋的茎仍处于存活状态，根据实验情况，可能会引入假象。

2. 茎切片

注意：请仔细阅读振动切片机使用手册，并遵守所有安全操作规程。

1. 确保样品载片清洁且完全干燥（无任何固体或液体残留）。使用剃刀片清洁样品载片，以去除先前实验中残留的胶水，并用水清洗，然后用纸巾擦干。
   注意：此步骤可确保粘合剂有效发挥作用并与琼脂糖样品牢固结合。若此步骤操作不当，样品可能无法牢固粘附于载片上，导致切片过程中样品从载片脱落。
   1. 使用柔软的纸巾去除含有样品的琼脂糖块表面的任何水分。
   2. 在样品载片上滴加少量组织粘合剂，用粘合剂瓶的尖端将粘合剂涂抹至载片中央区域。迅速将琼脂糖块放置于载片上，使样品方向与载片垂直或平行，分别用于获取横切面或纵切面。在室温或4 °C条件下静置10–30分钟，使粘合剂将样品固定于载片上。
      注意：此步骤需在规定时间内完成。
2. 将样品载片固定在缓冲槽或缓冲托盘中。琼脂糖块（含切片部分）应与剃刀片保持平行。向缓冲槽中加入室温蒸馏水，直至样品完全浸没。
3. 将剃刀片剪成两半，然后用坚固的剪刀修剪两端，确保刀片保持完全平整。将其中一半预切割的剃刀片安装至刀片夹上。
   1. 将刀片夹的角度设置为84°，速度设置为0.90 mm/sec（振动切片机第8档），频率设置为50 Hz（振动切片机第5档），切取厚度为100 µm的切片。使用连续切片模式。
      注意：选择此厚度是为了确保组织能够耐受某些染色方案中使用的各种酸性和碱性处理。设定切片窗口，并以连续模式运行振动切片机15–20分钟，以完成对约1.2 cm大小的琼脂糖块的切片。
4. 在缓冲槽中进行切片时，使用一次性塑料移液器收集切片。或者，可将切片从缓冲槽转移至玻璃烧杯，再转移至透明的培养皿中。将少量切片转移至2.0 ml微量离心管中。
   注意：从培养皿中收集切片是因为在透明背景下更易于观察切片，同时可使缓冲槽为下一个样品的切片做好准备。
5. 切片可暂时存放在50 ml离心管中，或收集后置于1.5至2 ml微量离心管中，在4 °C条件下保存30至60分钟。
   注意：长时间存放切片将导致图像质量下降。

3. 钙荧光白染色

1. 将 0.02 g 荧光增白剂 28（Calcofluor White M2R）溶于 10 ml 蒸馏水中，配制 0.2% 的储备液。0.2% 的溶液可置于 4 °C 暗瓶中保存六个月。使用蒸馏水将 0.2% 储备液稀释 10 倍，配制 0.02% 的工作液。
2. 将茎段转移至 2.0 ml 微量离心管中。向管中加入 1 ml 0.02% Calcofluor White 溶液。用移液器轻轻吹打 0.02% Calcofluor White 溶液数次。
   注意：请小心操作，避免将茎段吸入移液器吸头内，以免损伤组织。
   1. 室温孵育 5 分钟，再次轻轻吹打。继续在室温下孵育 3 分钟。
      注意：让茎段自然沉降到管底，以便于移除溶液时避免损伤组织。
   2. 使用 1 ml 移液器吸出 700 µl 0.02% Calcofluor White 溶液，加入 700 µl 蒸馏水；静置 5 分钟以清洗组织。重复此洗涤步骤 3–4 次。使用剪去尖端的 1 ml 移液器吸头，以便在不损伤组织的情况下顺利移取茎段。
   3. 轻轻将茎段吹打至移液器吸头中，并转移至显微镜载玻片上，加盖盖玻片。在紫外光下观察茎段。

结果

图1. 用于包埋茎段的自制模具。 左侧为2 ml螺口微型离心管的上部（A部分）和0.6 ml微型离心管的底部（B部分）。右侧为Parafilm膜将A和B两部分固定在一起，形成最终的模具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	EMD	MERC2125	CAS 编号: 9012-36-6
荧光增白剂 28 / 卡尔科弗卢尔白染色剂	Sigma	F3543	4,4'-双[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-苯胺基-1,3,5-三嗪-2-基]氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸 [CAS 编号 4404-43-7]
振动切片机	Leica	Leica 振动刀片切片机 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
剃刀	美国安全剃刀公司	货号 # 60-0139-0000	不锈钢双刃刀片（Personna Super）
螺帽微量离心管（2 ml）	VWR	16466-044
微量离心管（0.6 ml）	Axygen Scientific	MCT-060-C
隔热手套	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE 高温防护手套
组织粘合剂	Ted Pella 公司	10033	在 4 °C 或 20 °C 下保存 3 个月或更长时间
微波炉	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 快速组织粘合剂
方形显微盖玻片，No. 1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8") — 盖玻片耐腐蚀，厚度均匀且平整。No. 1 厚度为 0.13 至 0.17 mm。
磨砂显微载玻片，1 mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M	Alcan 包装公司	BRNDPM998