基于阴离子交换色谱的蛋白质纯化：一种根据净电荷从透析细菌裂解液中分离目标蛋白质的分离技术

摘要

来源：Fuehner, S.，等人S100A12及其离子诱导寡聚体的纯化用于免疫细胞刺激 J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了一种阴离子交换色谱技术，该技术利用人钙结合蛋白 S100A12 在大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中的净表面电荷，对其进行纯化。

方案

1. 蛋白质纯化

1. 阴离子交换层析
   1. 透析
      1. 通过将20 mM Tris、1 mM EDTA和1 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）溶解于去离子水中，并用HCl调节pH至8.5，配制阴离子交换层析（AIEX）缓冲液A。用于透析时准备2 × 5 L，用于层析时准备2 × 1 L的AIEX缓冲液A。
         注意： 透析液体积应约为样品体积的100倍。所有用于层析的缓冲液均需过滤（0.45 μm或更小孔径）并脱气（例如通过超声浴或真空脱气）。
      2. 将透析袋（分子量截留值[MWCO]：3.5 kDa）剪成适当长度，并预留足够空间以容纳空气，确保样品在旋转搅拌子上方保持浮起。
         注意： 甘油可保护透析膜，但使用前必须去除。
      3. 为降低澄清蛋白溶液的黏度，加入25 mL AIEX缓冲液A进行稀释，以便后续上样至层析柱。将第一个封口夹固定在透析袋一端，将样品装入膜内，并在距透析袋顶端至少1 cm处夹上第二个封口夹。
      4. 将装有AIEX缓冲液A的5 L容器置于搅拌台上，放入搅拌子以及装有蛋白溶液的透析膜。调节转速使样品旋转，同时避免与旋转的搅拌子发生碰撞。在4 °C下透析12–24小时，然后更换为新鲜预冷的透析液（AIEX缓冲液A），继续透析至少4小时以上。将透析后的蛋白溶液转移至50 mL离心管中，并通过0.45 μm滤器过滤。
         注意： 可进行储存。
   2. 层析
      1. 启动液相层析系统（FPLC），进行常规维护，连接AIEX缓冲液A和AIEX缓冲液B（含1 M NaCl的AIEX缓冲液A）以及装有阴离子交换树脂的层析柱。层析通用参数参见表1。
         注意： 缓冲液、层析柱及FPLC设备应在运行前平衡至相同温度（参见表1、表2中的层析参数）。
      2. 用AIEX缓冲液A平衡层析柱，随后将样品上样至柱中，并采用从0%到100%高盐缓冲液（AIEX B）的线性梯度洗脱蛋白。详细方法步骤参见表2。
      3. 在洗脱过程中收集每管2 mL的组分，取每管10 μL在考马斯亮蓝染色的15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上进行分析。合并含有S100A12蛋白的组分用于后续透析。
         注意： S100A12的分子量为10,575 Da。

结果

表1：阴离子交换色谱所用参数的详细信息。

柱体积（CV）	75 mL
监测波长	280 nM 处的吸光度
最大压力	3 bar
柱缓冲液 A	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8.5
柱缓冲液 B	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8.5
上样体积	可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels	BioRad	4561093
考马斯亮蓝 R250 脱色液	BioRad	1610438
考马斯亮蓝 R250 染色液	BioRad	1610436
EDTA 二钠盐二水合物	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Fast Flow	GE Healthcare	17-0510-01	阴离子交换色谱树脂
氯化钠 (NaCl)	Carl Roth	3957.2
氢氧化钠	Carl Roth	P031.1
Tris 碱	Carl Roth	4855.3
0.45 µm 注射器滤器	Merck	SLHA033SS
5 L 量杯	Carl Roth	CKN3.1
50 mL 圆锥形离心管	Corning	430829
透析袋夹	Spectrum	132738
5 mL 组分收集管	Greiner	115101
Spectra/Por 透析膜 (3.5 kDa)	Spectrum	132724
Steritop 滤器单元	Merck	SCGPT01RE
ÄKTA purifier UPC 10	GE Healthcare		FPLC 系统
组分收集器	GE Healthcare	Frac-920
Mini Protean Tetra 电泳槽	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Implen	P330
pH 计	Knick	765