基于阴离子交换色谱的蛋白质纯化:一种基于净电荷从透析的细菌裂解物中分离目标蛋白质的分离技术

摘要

来源:Fuehner， S. 等人。 用于免疫细胞刺激的人S100A12及其离子诱导寡聚体的纯化 J. Vis. Exp. （2019 年）

在本视频中，我们演示了一种阴离子交换色谱技术，该技术根据大肠杆菌培养物中蛋白质的净表面电荷来纯化人钙结合蛋白S100A12。

方案

1. 蛋白质纯化

1. 阴离子交换色谱法
   1. 透析
      1. 通过将 20 mM Tris、1 mM EDTA 和 1 mM 乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N、N、N'、N'-四乙酸 （EGTA） 溶解在去离子水中来制备阴离子交换色谱 （AIEX） 缓冲液 A，并用 HCl 将 pH 调节至 8.5。透析准备 2 x5 L，色谱准备 2x 1 L AIEX 缓冲液 A.
         注意:透析液体积应为样品体积的 100 倍左右。所有用于色谱分析的缓冲液都应过滤（0.45 μm 或更小）并脱气（例如，通过超声浴或真空脱气）。
      2. 将透析管（截留分子量 [MWCO]:3.5 kDa）切割成适当的长度，并留出额外的空气空间，以确保样品在旋转搅拌棒上方的浮力><。 注意:甘油会保护膜，使用前必须去除。
      3. 为了降低澄清蛋白质溶液的粘度，用 25 mL AIEX 缓冲液 A 稀释溶液，以便于随后应用到色谱柱中。将第一个瓶盖连接到管路上，将样品加载到膜中，并在距离管路顶端至少 1 cm 处连接第二个瓶盖。
      4. 将装有 AIEX 缓冲液 A 的 5 L 容器放在搅拌板上，加入搅拌棒和充满蛋白质溶液的膜。通过避免干扰旋转搅拌棒来调整速度以旋转样品。在 4 °C 下透析 12-24 小时，然后用新鲜的预冷制剂替换透析液缓冲液（AIEX 缓冲液 A），并继续至少 4 小时。将透析后的蛋白质溶液转移到 50 mL 试管中，并通过 0.45 μm 过滤装置过滤><。 注意:可存储。
   2. 色谱法
      1. 在进行一般维护的情况下启动液相色谱系统 （FPLC），连接色谱柱缓冲液 AIEX A 和 AIEX B（含 1 M NaCl 的 AIEX 缓冲液 A）和含阴离子交换树脂的色谱柱。一般色谱参数参见表 1。
         注意:在开始运行之前，缓冲液、色谱柱和 FPLC 设备应平衡至相同温度（参见表 1、表 2 中的色谱参数）。
      2. 用 AIEX 缓冲液 A 平衡色谱柱，然后将样品上样到色谱柱上，并以 0% 至 100% 高盐缓冲液 （AIEX B） 的线性梯度洗脱蛋白质。有关详细的方法方案，请参阅表 2。
      3. 在洗脱过程中收集 2 mL 馏分，并在考马斯染色的 15% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 上分析每种馏分的 10 μL。汇集含有S100A12蛋白的级分进行透析。
         注意:S100A12 的分子量为 10,575 Da。

结果

表 1:阴离子交换色谱应用参数的详细信息。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 柱床容积 （CV） 75 毫升 监控 280 nM 时的吸光度 最大压力 3 巴 色谱柱缓冲液 A 20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA，pH 8.5 色谱柱缓冲液 B 20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 M NaCl，pH 8.5 样品量 变量 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% 盐酸盐	卡尔·罗斯	X897.1
4−20% Mini-PROTEAN TGX 蛋白凝胶	生物辐射
4561093 考马斯 Briliant Blue R250 脱色液	生物辐射
考马斯 Briliant Blue R250 染色液	生物辐射
EDTA 二钠盐二水合	卡尔·罗斯	8043.1
EGTA	卡尔·罗斯	3054.3
Q Sepharose FF 填料	GE 医疗	17-0510-01	用于阴离子交换层析的填料
氯化钠 （NaCl）	卡尔·罗斯	3957.2
氢氧化钠	卡尔·罗斯	P031.1
Tris 底座	卡尔·罗斯	4855.3
0.45 和微量;M 针式过滤器	默克
5 L 量杯	卡尔·罗斯	CKN3.1
50 mL 锥形离心管	康宁
透析管盖	光谱
分收集管 5 mL	格雷纳
Spectra/Por 透析膜 （3.5 kDa）	光谱
Steritop 过滤器装置	默克	SCGPT01RE
ÄKTA 净化器 UPC 10	GE 医疗		FPLC 系统
馏分收集器	GE 医疗	Frac-920
Mini Protean Tetra Cell	生物辐射	1658000EDU
超微量分光光度计	实施	P330
pH 计	尼克	765