钙依赖性疏水相互作用色谱：一种基于疏水相互作用纯化钙结合蛋白的技术

摘要

来源：Fuehner, S., 等，人源 S100A12 及其离子诱导寡聚体的纯化用于免疫细胞刺激。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们展示了通过钙依赖性疏水相互作用色谱法从透析的细胞裂解液中纯化钙结合蛋白的过程。钙结合蛋白在与钙结合后会暴露出疏水区域，从而促进其与树脂上的疏水基团相互作用。随后，使用钙螯合剂EDTA洗脱这些蛋白质，以逆转该相互作用。

方案

1. 钙离子依赖性疏水相互作用色谱法（HIC）

1. 透析
   1. 将蛋白质溶液在20 mM Tris、140 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中透析
2. 色谱法
   1. 配制1 L疏水相互作用层析缓冲液HIC A：将20 mM Tris、140 mM NaCl和25 mM CaCl₂溶于去离子水中，调节pH至7.5。对于HIC缓冲液B，溶解20 mM Tris、140 mM NaCl和50 mM EDTA，调节pH至7.0，并对两种缓冲液进行过滤和脱气处理。向样品中加入CaCl₂，使其终浓度为25 mM，并通过0.45 µm滤膜过滤。将HIC缓冲液和样品平衡至4 °C（柱温）。
   2. 启动液相色谱系统并进行常规维护，连接疏水相互作用色谱缓冲液A和B以及色谱柱。参考 表1 用于进一步的色谱参数。
   3. 平衡柱子，上样，并延长“洗涤未结合样品”步骤，直至紫外信号再次达到基线水平。然后使用含钙螯合剂的缓冲液（EDTA）开始洗脱。参考 表 2 详细的实验方法方案。
      注意： 先前的实验表明，过量的钙似乎有利于S100A12与层析树脂的结合。
   4. 收集2 mL的洗脱峰组分，取每管10 µL在考马斯亮蓝染色的15% SDS-PAGE上进行分析。合并纯的S100A12组分，用HEPES缓冲盐水（HBS；20 mM HEPES，140 mM NaCl，pH 7.0）透析。
      注意： S100A12单体的消光系数为2980 M-1 cm-1。

结果

表1： 疏水相互作用色谱所用参数的详细信息。

平衡	体积	缓冲液	出口
上样前平衡	1−2 柱体积（CVs）	A	废液
样品上样	不适用	A	废液
洗去未结合样品	1−2 CVs	A	高体积出口<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Carl Roth	8043.1
苯基 Sepharose 高性能树脂	GE Healthcare	17-1082-01	疏水相互作用色谱用树脂
氯化钠 (NaCl)	Carl Roth	3957.2
氢氧化钠	Carl Roth	P031.1
Tris 碱	Carl Roth	4855.3
25% HCl	Carl Roth	X897.1
氯化钙二水合物	Carl Roth	5239.1
实验耗材
0.45 µm 注射器滤器	Merck	SLHA033SS
14 mL 圆底管	BD	352059
2 L 锥形瓶	Carl Roth	LY98.1
5 mL 组分收集管	Greiner	115101
Spectra/Por 透析膜 (3.5 kDa)	Spectrum	132724
Steritop 滤器单元	Merck	SCGPT01RE
仪器设备
组分收集器	GE Healthcare	Frac-920