基于镍亲和层析的蛋白质纯化：一种从细菌细胞裂解液中纯化聚组氨酸标签重组蛋白的技术

摘要

来源：Pokhrel, A. 等 A 纯化与 体外 (p)ppGpp合成酶活性检测 艰难梭菌. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了利用镍亲和层析技术从艰难梭菌（Clostridium difficile）中纯化带有组氨酸标签的焦磷酸激酶酶的方法。

方案

1. 蛋白质的镍亲和层析纯化

1. 使用重力柱上的1 mL镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）树脂纯化蛋白质。
   1. 使用前一天，在4 °C条件下用2 mL平衡缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.79，300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，0.5 mg/mL溶菌酶，5 mM MgCl₂，10 mM咪唑，0.25 mM DTT，5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），10%甘油）对柱子进行过夜平衡。
   2. 次日，将柱子从4 °C移至室温，再上样澄清裂解液，并静置约2–3小时。
      注意：将柱子恢复至热平衡状态至关重要，以避免柱内产生气泡。
   3. 用裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.8，300 mM NaCl，5 mM MgCl₂，50 mM NaH₂PO₄，10%甘油，0.5 mg/mL溶菌酶，10 mM咪唑，0.25 mM DTT和5 mM PMSF）重悬沉淀。
   4. 在冰上进行超声处理，每次10秒，共8次，脉冲之间间隔30秒。
   5. 将裂解液在4 °C条件下以3,080 × g离心30分钟，使用微量离心机进行澄清。
   6. 用等体积的裂解缓冲液稀释裂解液，然后将制备好的澄清裂解液上样至柱子，并收集穿流液。
   7. 将澄清裂解液的穿流液重新上样至柱子，并收集第二次穿流液。
   8. 用洗涤缓冲液1（10 mM Tris-HCl（pH 7.79），300 mM NaCl，5 mM MgCl₂，50 mM NaH₂PO₄，30 mM咪唑，10%甘油）洗涤柱子。收集穿流液。
      注意：在洗涤和洗脱缓冲液中加入5 mM MgCl₂对纯化蛋白的酶活性至关重要。
   9. 用洗涤缓冲液2（10 mM Tris-HCl（pH 7.79），300 mM NaCl，5 mM MgCl₂，50 mM NaH₂PO₄和50 mM咪唑）洗涤柱子。
   10. 收集穿流液。
   11. 加入2 mL洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.79），300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，10%甘油和75 mM咪唑）。将洗脱液分为两份，每份1 mL，分别收集。
       注意：若后续纯化实验中需再次纯化同一种蛋白，此步骤后的柱子可在4 °C条件下保存于平衡缓冲液中。若保存得当，柱子最多可使用3次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镍-NTA 树脂	G Biosciences	786-940/941
Pierce 一次性重力层析柱，10 mL	Thermo Scientific	29924
1 mL Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 透析装置（截留分子量：20-kD）	Spectrum	G235033
超声波处理器	Sonics	VC-750
配备 D3024/D3024R 转子的微量离心机	Scilogex