基于薄层色谱法的分枝杆菌酸变体分离:一种基于极性分离分枝杆菌细胞壁脂质的方法

摘要

来源:Guallar-Garrido， S. 等人 通过薄层色谱分析分枝杆菌的脂质组成。J. Vis. Exp.（2021 年）。

该视频演示了基于薄层色谱的霉菌酸分离方法。该技术根据分枝杆菌的极性分离不同的分枝杆菌酸（分枝杆菌细胞壁中存在的长链脂质）。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 从分枝杆菌中提取总非共价连接脂质（图 1）

1. 从固体培养基中刮擦 0.2 g 分枝杆菌，并加入带有聚四氟乙烯 （PTFE） 衬垫螺帽的玻璃管中。加入由 5 mL 氯仿和 10 mL 甲醇（氯仿:甲醇，1:2）组成的溶液><。 注意:使用有机溶剂时，只能使用玻璃容器。不允许使用塑料容器。此外，还需要用于瓶子的 PTFE 衬里螺旋盖。
   谨慎:氯仿是一种具有潜在毒性且极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:甲醇是一种具有潜在毒性和极度危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
2. 将试管不断搅拌过夜，以从分枝杆菌细胞表面提取非共价连接的脂质><。 注意:如果没有轨道振荡平台，则可以尽可能频繁地用定期手动搅拌来代替恒定搅拌。
3. 用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，然后将它们收集在玻璃管中。
4. 使用氮气通量蒸发管中的液相。用氮气填充试管，盖上盖子并储存在 4 °C.
   注意:将玻璃巴斯德移液器连接到氮气流中，以专门蒸发所需的试管。此外，将管子保持在 37 °C 的管子干块加热器内。当溶剂蒸发时，在关闭试管之前用氮气填充试管。
5. 向细胞碎片中加入 15 mL 氯仿:甲醇 （2:1） 溶液。将试管不断搅拌过夜，以从分枝杆菌细胞表面提取非共价连接的脂质><。 注意:如果没有轨道振荡平台，则可以尽可能频繁地用定期手动搅拌来代替恒定搅拌。
6. 让混合物静置 1 小时。使用巴斯德移液器回收有机溶剂。用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂并将它们收集在先前在步骤 1.3 中使用的同一玻璃管中。使用氮气通量蒸发管中的液相。用氮气填充试管，关闭并再次储存在 4 °C。

2. 通过酸性甲烷分解提取霉菌酸（图 2A）

1. 将 2-5 mL 酯化溶液加入带有 PTFE 衬垫螺帽的密封玻璃管中。将 0.2 g 分枝杆菌生物质加入玻璃管中。
   注意:将 30 mL 甲醇、15 mL 甲苯和 1 mL 硫酸混合形成酯化溶液。分枝杆菌细胞可以从固体培养物中提取，甚至可以从分枝杆菌中提取总非共价连接脂质（在步骤 1.6 中过滤后的剩余细胞）中提取脱脂细胞><。 谨慎:甲苯是一种易燃且极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:硫酸是一种腐蚀性和危险物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
2. 通过涡旋混合内容物。让混合物在 80 °C 的干燥浴中静置过夜。
3. 让试管冷却直至达到室温，然后向试管中加入 2 mL 正己烷。涡旋 30 秒混合内容物，让试管沉降，直到出现两个透明相。
   注意:正己烷是一种潜在的易燃、刺激性、对环境有害且极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
4. 恢复对应于正己烷相的上层相。将其转移到新管上。
5. 重复步骤 2.3。再次恢复上层相并将其转移到步骤 2.4 中使用的同一管中。
6. 使用氮气助焊剂蒸发管中的内容物。用氮气填充试管，关闭，并将其储存在 4 °C。

3. 通过皂化和甲基化提取霉菌酸（图 2B）

1. 从固体培养基中刮擦 0.2 g 分枝杆菌，并加入带有 PTFE 螺帽的玻璃管中。
2. 加入 2 mL 含 5% 氢氧化钾的甲醇-苯溶液 （80:20）。涡旋混合内容物。将混合物在 100 °C 下加热 3 小时。
   谨慎:苯是一种易燃、致癌和有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
3. 让试管冷却至室温。加入 20% 硫酸使样品酸化，使 pH = 1。
4. 加入 3 mL 乙醚。涡旋轻轻混合内容物。
5. 让这两个阶段通过沉淀形成。回收乙醚固定相并转移到新试管中。重复洗涤步骤总共 3 次。
6. 用 2 mL 蒸馏水洗涤乙醚提取物，并将对应于乙醚的上部转移到新管中。重复洗涤步骤总共 3 次。
7. 在乙醚提取物上加入 2 g 无水硫酸钠干燥。
8. 过滤悬浮液。使用氮气助焊剂蒸发内容物。
9. 要执行甲基化步骤，将 3 g N-亚硝基-N-甲基脲溶解在由 45 mL 乙醚和 9 mL 40% KOH 在蒸馏水中形成的预冷溶液><中。 谨慎:N-亚硝基-N-甲基脲是一种有毒、刺激性、致癌性和有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
10. 将上清液（重氮甲烷）转移到在含有氢氧化钾颗粒（约 30 g）的冰中冷却的新烧瓶><中。 注意:如果上清液不立即使用，则可以在 -20 °C 下储存最多 1 小时
    谨慎:氢氧化钾颗粒是一种刺激性和腐蚀性物质。这种材料必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:重氮甲烷具有剧毒和潜在爆炸性。它必须在带有安全眼镜的层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
11. 将 2 mL 在步骤 3.10 中获得的含有重氮甲烷的乙醚溶液加入到步骤 3.8 中获得的含有霉菌酸的干燥二乙醚提取物中。在室温下孵育 15 分钟。
12. 在 40 °C 下蒸发悬浮液。用氮气填充试管，关闭，并将甲基化脂质储存在 4 °C.
    注意:在层流罩下从乙醚溶液中蒸发重氮甲烷，直到乙醚失去黄色。

4. 薄层色谱 （TLC） 分析

1. 使玻璃 TLC 腔室饱和。为此，请用一张滤纸覆盖 TLC 室的一壁，并使其与溶剂混合物组成的流动相接触。将剩余体积的溶剂放在 TLC 室的底部。
   注意:TLC 室的底部必须被至少 1 cm 的流动相覆盖。在本实验中，使用不同的流动相来开发 TLC。它们由 85 mL 正己烷和 15 mL 乙醚组成;100 mL 二氯甲烷;90 mL 氯仿、10 mL 甲醇和 1 mL 水;30 mL 氯仿，加上 8 mL 甲醇和 1 mL 水;60 mL 氯仿，加上 35 mL 甲醇和 8 mL 水;95 mL 氯仿加 5 mL 甲醇;和 90 mL 石油醚 （60-80 °C） 加 10 mL 乙醚><。 注意:在二维 TLC 中，在第一个方向上使用正己烷:丙酮 （95:5） 3 次，并在第二个方向使用甲苯:丙酮 （97:3） 的单次显影来分析霉菌酸组成。要分析 PIM，在第一个方向上使用氯仿:甲醇:水 （60:30:6） 一次，在第二个方向使用氯仿:乙酸:甲醇:水 （40:25:3:6）。为了分析 PDIM 和 AG，在第一个方向上使用石油醚 （60-80 °C）:乙酸乙酯 （98:2） 三次，并在第二个方向使用石油醚 （60-80 °C）:丙酮 （98:2） 的单次显影><。 谨慎:二乙醚是一种具有潜在毒性和有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:二氯甲烷是一种具有潜在毒性和有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:石油醚是一种潜在的易燃、对环境有害且极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:乙酸是一种潜在的易燃和腐蚀性物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:乙酸乙酯是一种易燃有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:丙酮是一种易燃有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。
2. 关闭 TLC 腔室使其饱和至少 20 分钟。同时，将玻璃管中存在的脂质溶解在 0.2-1 mL 氯仿><中。 注意:用于溶解脂质的体积可以根据样品的所需或预期浓度进行修改。
3. 使用毛细管玻璃管将每种悬浮液 10 μL 直接涂抹在 TLC 板上，让样品在室温下干燥 5 分钟><。 注意:样品必须涂在板的底部，每侧留出 1 cm。样品必须彼此分开至少 0.5 cm。将样品涂在板上后，可以再次用氮气蒸发试管并储存在 4 °C 以备进一步使用。
4. 将板插入含有流动相的饱和 TLC 室中。让流动相通过 TLC.
   注意:施加在 TLC 室上的任何移动都会影响板上的流动溶剂并影响脂质迁移率。在进行二维 TLC 的情况下，需要两个 TLC 室来包含两个洗脱系统。
5. 当溶剂距离板上端 1 cm 时，从 TLC 室中取出板。将板置于层流助熔剂下，直到二氧化硅完全干燥。
   注意:在分析霉菌酸组成的情况下，使用正己烷和二乙醚 （85:15），重复步骤 4.4 和 4.5 两次以上，直到流动相在 TLC 板上运行三次。
6. 露出带有所需染色剂的板;如果需要，加热板。
   注意:在本实验中，使用 15-20 mL 以下溶液喷涂 TLC 板:将 10% 钼磷酸水合物在乙醇中，直到板呈亮黄色，然后在 120 °C 下加热板;在乙醇中加入 5% 的 20% α-萘酚的硫酸溶液，然后在 120 °C 下加热板;钼蓝试剂（1.3% 氧化钼溶于 4.2 M 硫酸中）直至出现磷酸盐条带或 1% 蒽酮溶于硫酸><中。 谨慎:Molybdatophosphateic acid hydrate 是一种易燃和腐蚀性物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:乙醇是一种潜在的易燃和有害物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 注意:1-萘酚是一种易燃、腐蚀性和极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套><）。 谨慎:钼蓝喷雾试剂是一种腐蚀性、毒性和极其危险的物质。它必须在层流罩中使用，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和丁腈手套）。

结果

图 1:提取在固体培养基上生长的分枝杆菌脂质含量的程序方案。破译分枝杆菌细胞上存在的脂质的主要步骤。

图 2:提取在固体培养基上生长的分枝杆菌的分枝杆菌酸含量的程序方案。使用 （A） 酸甲烷分解或 （B） 皂化破译分枝杆菌细胞上存在的分枝杆菌酸的主要步骤。

材料