基于薄层色谱法分离分枝杆菌酸变体：一种根据极性分离分枝杆菌细胞壁脂质的方法

摘要

来源：Guallar-Garrido, S.，等。通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了基于薄层色谱法分离分枝菌酸的技术。该技术根据分枝菌酸——存在于分枝杆菌细胞壁中的长链脂质——的极性差异实现不同类型分枝菌酸的分离。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从分枝杆菌中提取总非共价结合脂质（图1）

1. 从固体培养基上刮取 0.2 g 分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的玻璃管中。加入由 5 mL 氯仿和 10 mL 甲醇组成的溶液（氯仿:甲醇，1:2）。
   注意：使用有机溶剂时，只能使用玻璃容器，禁止使用塑料容器。此外，瓶子必须使用带 PTFE 衬垫的螺旋盖。
   警告：氯仿是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈类手套）。
   警告：甲醇是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈类手套）。
2. 将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。
   注意：若无轨道摇床，可用尽可能频繁的手动搅拌代替持续搅拌。
3. 用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并收集至玻璃试管中。
4. 使用氮气流吹干试管中的液相。用氮气充满试管，盖好后于 4 °C 保存。
   注意：可将玻璃巴斯德吸管连接至氮气流，专门用于吹干目标试管。此外，将试管置于 37 °C 的干式恒温金属浴中。当溶剂完全蒸发后，在封闭前先用氮气充满试管。
5. 向细胞残渣中加入 15 mL 氯仿:甲醇（2:1）溶液。将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。
   注意：若无轨道摇床，可用尽可能频繁的手动搅拌代替持续搅拌。
6. 让混合物静置 1 小时。用巴斯德吸管回收有机溶剂。用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并收集至第 1.3 步中使用的同一玻璃试管中。使用氮气流吹干试管中的液相。用氮气充满试管，盖好并再次于 4 °C 保存。

2. 通过酸性甲醇解提取分枝菌酸（图2A）

1. 向带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的密闭玻璃管中加入 2–5 mL 酯化溶液。将 0.2 g 分枝杆菌生物量加入该玻璃管中。
   注意：酯化溶液由 30 mL 甲醇、15 mL 甲苯和 1 mL 硫酸混合而成。分枝杆菌细胞可来自固体培养物，也可来自在提取分枝杆菌中全部非共价结合脂质后所得的脱脂细胞（即步骤 1.6 过滤后剩余的细胞）。
   警告：甲苯为易燃且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
   警告：硫酸为腐蚀性且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
2. 通过涡旋混合内容物。将混合物置于 80 °C 干浴中静置过夜。
3. 让试管冷却至室温，然后向试管中加入 2 mL 正己烷。涡旋振荡 30 秒以混合内容物，静置试管直至出现两个清晰的相层。
   警告：正己烷为潜在易燃、刺激性、对环境有害且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
4. 收集对应于正己烷相的上层相，并转移至新试管中。
5. 重复步骤 2.3。再次收集上层相，并转移至步骤 2.4 中使用的同一试管中。
6. 使用氮气气流吹干试管中的内容物。用氮气充满试管，密封后于 4 °C 保存。

3. 通过皂化和甲基化提取分枝菌酸（图2B）

1. 从固体培养基上刮取0.2 g分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）螺旋盖的玻璃试管中。
2. 加入2 mL甲醇-苯溶液（80:20），其中含5%氢氧化钾。通过涡旋混合内容物。将混合物在100 °C下加热3小时。
   注意：苯为易燃、致癌且具有危害性的物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
3. 让试管冷却至室温。加入20%硫酸将样品酸化至pH = 1。
4. 加入3 mL乙醚。通过涡旋轻轻混合内容物。
5. 静置使两相分层。收集乙醚相并转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。
6. 用2 mL蒸馏水洗涤乙醚提取物，将上层乙醚相转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。
7. 向乙醚提取物中加入2 g无水硫酸钠以进行干燥。
8. 过滤悬浮液。使用氮气流吹干内容物。
9. 进行甲基化步骤时，将3 g N-亚硝基-N-甲基脲溶解于预冷的溶液中，该溶液由45 mL乙醚和9 mL 40% KOH水溶液组成。
   注意：N-亚硝基-N-甲基脲为有毒、刺激性、致癌且具有危害性的物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
10. 将上清液（重氮甲烷）转移至另一已置于冰中冷却的烧瓶中，烧瓶内含氢氧化钾颗粒（约30 g）。
    注意：若上清液不能立即使用，可在-20 °C下保存最多1小时。
    注意：氢氧化钾颗粒为刺激性和腐蚀性物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
    注意：重氮甲烷具有高度毒性且可能爆炸，必须在配备安全玻璃的层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
11. 将步骤3.10中获得的含重氮甲烷的乙醚溶液2 mL加入步骤3.8中获得的含分枝菌酸的干燥乙醚提取物中。在室温下孵育15分钟。
12. 在40 °C下蒸发悬浮液。用氮气充满试管，密封后于4 °C保存甲基化脂质。
    注意：在层流罩中蒸发乙醚溶液中的重氮甲烷，直至乙醚失去黄色。

4. 薄层色谱（TLC）分析

1. 使玻璃薄层色谱（TLC）展开槽充分饱和。为此，将一张滤纸贴在TLC展开槽的一侧内壁上，并使其与由混合溶剂组成的流动相接触。将剩余的溶剂倒入TLC展开槽底部。
   注意： TLC展开槽底部必须至少覆盖1 cm深的流动相。在本实验中，使用了不同的流动相来展开TLC板。这些流动相包括：85 mL正己烷加15 mL乙醚；100 mL二氯甲烷；90 mL氯仿、10 mL甲醇和1 mL水；30 mL氯仿加8 mL甲醇和1 mL水；60 mL氯仿加35 mL甲醇和8 mL水；95 mL氯仿加5 mL甲醇；以及90 mL石油醚（60–80 °C）加10 mL乙醚。
   注意： 在二维TLC分析中，第一方向使用正己烷:丙酮（95:5）展开三次，第二方向使用甲苯:丙酮（97:3）单次展开，用于分析分枝菌酸组成。分析磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIMs）时，第一方向使用氯仿:甲醇:水（60:30:6）展开一次，第二方向使用氯仿:乙酸:甲醇:水（40:25:3:6）展开。分析分枝菌酸二酯（PDIM）和阿拉伯半乳聚糖（AG）时，第一方向使用石油醚（60–80 °C）:乙酸乙酯（98:2）展开三次，第二方向使用石油醚（60–80 °C）:丙酮（98:2）单次展开。
   警告： 乙醚是一种潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 二氯甲烷是一种潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 石油醚是一种易燃、对环境有害且极度危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 乙酸是一种易燃且具有腐蚀性的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 乙酸乙酯是一种易燃且危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 丙酮是一种易燃且危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
2. 关闭TLC展开槽，使其饱和至少20分钟。在此期间，将玻璃试管中的脂质溶解于0.2–1 mL氯仿中。
   注意： 溶解脂质所用体积可根据样品预期浓度进行调整。
3. 使用毛细玻璃管将每种悬浮液各取10 µL直接点样于TLC板上，并在室温下干燥5分钟。
   注意： 样品应点在板的底部区域，两侧各留出1 cm空间，各样品点之间至少相距0.5 cm。点样完成后，试管可用氮气吹干，并于4 °C保存以备后续使用。
4. 将TLC板插入含有流动相的饱和展开槽中，让流动相沿板展开。
   注意： 任何对TLC展开槽的移动都会影响板上溶剂的运行，从而影响脂质的迁移。若进行二维TLC分析，则需要两个TLC展开槽分别容纳两种洗脱系统。
5. 当溶剂前沿距离TLC板顶端1 cm时，取出TLC板，并置于层流条件下直至硅胶完全干燥。
   注意： 若分析分枝菌酸组成并使用正己烷:乙醚（85:15）作为流动相，需重复步骤4.4和4.5两次，使流动相共展开三次。
6. 使用所需的显色剂显色；如需加热，则对板进行加热。
   注意： 在本实验中，使用15–20 mL以下溶液喷雾显色：10%磷钼酸水合物乙醇溶液，喷至板呈亮黄色，随后在120 °C加热；5% α-萘酚乙醇溶液（由20% α-萘酚硫酸溶液配制），喷后在120 °C加热；钼蓝试剂（4.2 M硫酸中含1.3%三氧化钼），喷至磷酸酯条带显现；或1%蒽酮硫酸溶液。
   警告： 磷钼酸水合物是一种易燃且具有腐蚀性的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 乙醇是一种潜在易燃且危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 1-萘酚是一种易燃、具有腐蚀性且极度危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
   警告： 钼蓝喷雾试剂是一种具有腐蚀性、毒性且极度危险的物质，必须在层流罩中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。

结果

图1：从固体培养基上培养的分枝杆菌中提取脂质成分的流程示意图。 解析分枝杆菌细胞中所含脂质的主要步骤。

图 2：从固体培养基上培养的分枝杆菌中提取分枝菌酸含量的操作流程示意图。 利用（A）酸性甲醇解或（B）皂化方法解析分枝杆菌细胞中所含分枝...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	默克	100063	警告：无水分析纯 EMSURE® ACS，ISO，Reag. Ph Eur
丙酮	Carlo Erba	400971N	警告：分析用丙酮 RPE-ACS-ISO，1000 毫升
蒽酮	默克	8014610010	用于合成的蒽酮
苯	Carlo Erba	426113	警告：苯 RPE - 用于分析 - ACS 2.5 L
毛细玻璃管	默克	BR708709	品牌® 一次性 BLAUBRAND® 微量移液器，intraMark
氯仿	Carlo Erba	412653	警告。氯仿 RS - 用于高效液相色谱 - 等度级 - 以乙醇稳定 2.5 L
干浴加热器	J.P. Selecta	7471200
二氯甲烷	Carlo Erba	412622	警告：二氯甲烷 RS - 用于高效液相色谱 - 等度级 - 以2.5%亚甲基戊烯稳定化 2.5 L
乙醚	Carlo Erba	412672	警告：二乙醚对照品 - 用于高效液相色谱 - 等度洗脱级 - 未稳定化 2.5 L
乙酸乙酯	Panreac	1313181211	警告：乙酸乙酯（分析纯，ACS，ISO，Reag. USP，Ph. Eur.）
无水乙醇	Carlo Erba	4146072	警告：无水乙醇 RPE - 分析用 - ACS - 欧洲药典试剂 - 美国药典试剂 1 L
玻璃漏斗	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
玻璃管	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	带聚四氟乙烯内衬盖的玻璃管
甲醇	Carlo Erba	412722	警告：甲醇 RS - 用于HPLC - GOLD - 超梯度级，2.5 L
钼磷酸水合物	默克	51429-74-4	警告
1.3% 钼蓝喷雾试剂	Sigma	M1942-100ML	警告
正己烷	Carlo Erba	446903	警告：正己烷 99% RS - ATRASOL - 痕量分析用 2.5 L
N-亚硝基-N-甲基脲	Sigma	N4766	警告
轨道摇床平台	DDBiolab	995018	NB-205L 台式振荡培养箱
石油醚（60-80）ºC)	Carlo Erba	427003	警告：石油醚 60 - 80°C RPE - 用于分析 2.5 L
喷雾器	VidraFOC	712/1
无水硫酸钠	默克	238597
硫酸 95-97%	默克	1007311000	警告：硫酸 95-97%
薄层色谱展开槽	默克	Z204226-1EA	矩形薄层色谱展开槽，完整套装 L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
薄层色谱板	默克	1057210001	TLC 硅胶 60-20×20 cm × 25 μm
薄层色谱板加热器	CAMAG	223306	CAMAG 薄层色谱加热板 III
甲苯	Carlo Erba	488551	警告。甲苯 RPE - 用于分析 - ISO - ACS - 欧洲药典试剂 - 美国药典试剂 1 L
涡旋混合	Fisher Scientific	10132562	IKA IKA 摇床órtex 3
1-萘酚	Sigma-Aldrich	102269427	警告