基于肝素亲和层析的杆状病毒纯化：一种从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术

摘要

来源：Nasimuzzaman, M. 等，用于基因治疗应用的杆状病毒的生产与纯化。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了使用肝素亲和层析法从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术。该分离过程依赖于层析柱中的肝素与杆状病毒包膜糖蛋白之间的亲和性。

方案

1. 色谱系统的准备

1. 通过依次用无菌水、1 N 氢氧化钠、水和洗涤缓冲液（含150 mM氯化钠的20 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0）以50 mL/min的线性流速冲洗样品管路和缓冲液管路，来准备色谱系统。
2. 通过依次以7 mL/min的线性流速运行柱清洗缓冲液（5 CV含2 M氯化钠的无菌20 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0）和5 CV洗涤缓冲液，准备一根肝素50 µm柱（10 × 10 cm，柱体积（CV）为7.9 mL）。

2. 杆状病毒载体的纯化

1. 按如下步骤设置层析系统：
   1. 使用样品加载进样口加载杆状病毒上清液。
   2. 使用缓冲液进样口 A1 加载洗涤缓冲液。准备一个至少含有 500 mL 洗涤缓冲液的瓶子，并将洗涤缓冲液管路插入瓶中。
   3. 使用缓冲液进样口 A2 加载洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠，含 1.5 M 氯化钠，pH 8.0）。准备一个至少含有 500 mL 洗脱缓冲液的瓶子，并将洗脱缓冲液管路插入瓶中。
   4. 在组分收集器中插入多个 50 mL 圆锥形离心管，用于收集流穿的杆状病毒上清液、洗涤缓冲液以及洗脱的杆状病毒。
2. 用五倍柱体积（5 × 7.9 mL，共 40 mL）的洗涤缓冲液，以 7.0 mL/min 的线性流速平衡肝素层析柱。
3. 使用层析系统的样品泵（进样口）以 2.0 mL/min 的线性流速将 250 mL 杆状病毒上清液上样至肝素层析柱。
4. 以 2.0 mL/min 的线性流速将 10 倍柱体积（80 mL）的洗涤缓冲液通过肝素层析柱，直至紫外（UV）吸收曲线（280 nm）恢复至基线并保持稳定。
5. 以 4.0 mL/min 的线性流速，用 5 倍柱体积（40 mL）的洗脱缓冲液从 7.9 mL 肝素层析柱中洗脱杆状病毒颗粒。当杆状病毒颗粒从肝素柱上解离时，注意观察色谱图上出现的明显蛋白质洗脱峰。
6. 洗脱后，立即用 20 mM 磷酸钠水缓冲液将洗脱得到的杆状病毒上清液稀释 10 倍，以防止后续离心过程中因渗透压冲击导致杆状病毒颗粒失活。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	层析系统
POROS Heparin 50 µm 色谱柱	ThermoFisher Scientific	4333414	肝素色谱柱
洗涤缓冲液	本实验室制备	非目录产品	含150 mmol/l氯化钠的20 mmol/l磷酸盐缓冲液
洗脱缓冲液	本实验室制备	非目录产品	含1.5 mol/l氯化钠的20 mmol/l磷酸盐缓冲液
50 ml 圆底离心管	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	用于收集杆状病毒上清液
色谱柱清洗缓冲液	本实验室制备	非目录产品	含2.0 mol/l氯化钠的20 mmol/l磷酸盐缓冲液
无菌水	本实验室制备	非目录产品	用于Akta Avant系统的清洗
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	1.09137	用于Akta Avant系统的清洗