基于肝素亲和层析的杆状病毒纯化:一种从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术

摘要

来源:Nasimuzzaman， M. et al.， 用于基因治疗应用的杆状病毒的生产和纯化。J. Vis. Exp.（2018 年）

在本视频中，我们演示了使用肝素亲和色谱法从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术。色谱柱中的肝素与杆状病毒包膜糖蛋白之间的亲和力促进了分离。

方案

1. 色谱系统的制备

以
1. 50 mL/min 的线性流速依次用无菌水、1 N 氢氧化钠、水和洗涤缓冲液（20 mM 磷酸钠缓冲液，含 150 mM 氯化钠，pH 7.0）冲洗样品和缓冲液管路，以制备色谱系统。
2. 通过依次运行色谱柱清洁缓冲液（5 CV 无菌 20 mM 磷酸钠缓冲液，含 2 M 氯化钠，pH 7.0）和 5 CV 洗涤缓冲液，制备肝素 50 μm 色谱柱（10 × 10 cm，7.9 mL 柱体积 （CV））以 7 mL/min 的线性流速。

2. 杆状病毒载体的纯化

1. 按如下方式设置色谱系统:
   1. 使用样品上样液口上样杆状病毒上清液。
   2. 使用缓冲液入口 A1 上样洗涤缓冲液。准备一个装有至少 500 mL 洗涤缓冲液的瓶子，并将洗涤缓冲液管线放入瓶中。
   3. 使用缓冲液入口 A2 上样洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠和 1.5 M 氯化钠，pH 8.0）。准备一个装有至少 500 mL 洗脱缓冲液的瓶子，并将洗脱缓冲液管线放入瓶中。
   4. 将几支 50 mL 锥形管插入馏分收集器中，以收集色谱柱直通杆状病毒上清液、洗涤缓冲液和洗脱的杆状病毒。
2. 用 5 个 7.9 mL 柱体积 （CV） 的洗涤缓冲液 （40 mL） 以 7.0 mL/min 的线性流速平衡肝素柱。
3. 使用色谱系统的样品泵（入口样品端口）以 2.0 mL/min 的线性流速将 250 mL 杆状病毒上清液上样到肝素柱上。
4. 以 2.0 mL/min 的线性流速通过肝素柱运行 10 CV （80 mL） 洗涤缓冲液，直到紫外 （UV） 吸光度曲线 （280 nm） 恢复到基线并变得稳定。
5. 用 5 CV （40 mL） 洗脱缓冲液以 4.0 mL/min 的线性流速洗脱 7.9 mL 肝素柱上的杆状病毒颗粒。当杆状病毒颗粒从肝素柱上解离时，观察色谱图上蛋白质的尖锐洗脱峰。
6. 洗脱后，立即使用 20 mM 磷酸钠缓冲液在水中将洗脱的杆状病毒上清液稀释 10 倍，以防止杆状病毒颗粒在随后的离心过程中因渗透压休克而失活。

材料