阳离子交换色谱法：一种基于净表面电荷从昆虫细胞裂解液中分离目标重组蛋白的技术

摘要

来源：Agamasu, C. 等. 完全修饰的重组KRAS4b：分离与表征法尼基化及甲基化蛋白. 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了利用阳离子交换层析技术从昆虫细胞蛋白裂解液中分离重组蛋白的方法。

方案

1. 蛋白质纯化

1. 配制缓冲液 A–H，见表1。

缓冲液	缓冲剂（均为 20 mM）	pH	NaCl (mM)	咪唑 (mM)	MgCl2	TCEP
A	HEPES	7.3	300	-	5	1
B	HEPES	7.3	300	35	5	1

结果

图1：蛋白质纯化过程的SDS-PAGE凝胶图。（A）来自裂解液的IMAC捕获。FNTA/B为迁移至约48 kDa处的深色条带，His6-MBP-tev-KRAS4b为迁移至约67 kDa处的深色条带。M = 蛋白质分子量标准；T = 总蛋白；L = 澄清裂解液/上柱样品；F = 穿流液。各组分以逐渐增加的咪唑浓度梯度洗脱。（B）CEX组分，标记1–5对应于洗脱峰中的主峰组分。（C）TEV酶切及第二次IMAC。C = TEV酶切前CEX步骤的合并组分；L = TEV酶切后上样样品。目标蛋白种类已标注。（D）最终KRAS4b-FMe蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.8 mL 安全锁扣管，本色	Eppendorf	22363204
11 mm 带盖不锈钢互锁式自动进样瓶	Thermo Scientific	30211SS-1232
5427R 离心机	Eppendorf
乙腈，HPLC 级	Fisher Chemical	A998-1 1L
阳离子交换色谱柱（CEX）	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose High Performance
Exactive Plus EMR 质谱仪	Thermo Scientific
Gilson 7x14 mm 小瓶	GE Healthcare	BR-1002-12
高速/台式离心机	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	最高可达 4,000 ×g
His6-烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶	Addgene	92414	根据 Raran-Kurussi 等（2017）方法纯化：TEV 蛋白酶去除亲和标签。见：Burgess Brown N.（编）《大肠杆菌中异源基因表达》，《分子生物学方法》第 1586 卷，Humana Press，纽约
不含 EDTA 或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物	Millipore Sigma	P8849
乙酸铵	Sigma-Aldrich	09689-250g
氩气	Airgas	ARUP
甲酸	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	使用试剂级或更高级别
NGC 色谱系统	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 色谱系统
带支架的脂质挤出装置套装	AVANTI POLAR LIPIDS	610023
液氮	Airgas	NI-DEWAR
Ultra-15 离心过滤单元，10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	PES 膜
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 离心过滤器	Amicon	UFC501024
超速离心机	Beckman Coulter	Optima - L80K	最高可达 100,000 ×g
CHAPS	Sigma	C3023