来源：Agamasu, C. 等. 完全修饰的重组KRAS4b：分离与表征法尼基化及甲基化蛋白. 视频实验杂志 (2020)
本视频演示了利用阳离子交换层析技术从昆虫细胞蛋白裂解液中分离重组蛋白的方法。
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方法文章
阳离子交换色谱法：一种基于净表面电荷从昆虫细胞裂解液中分离目标重组蛋白的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 蛋白质纯化
- 配制缓冲液 A–H，见表1。
| 缓冲液 | 缓冲剂（均为 20 mM） | pH | NaCl (mM) | 咪唑 (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | HEPES | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | MES | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | MES | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | MES | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | MES | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | HEPES | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- 准备纯化材料（参见材料表）：不含EDTA或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物；固定化金属亲和层析（IMAC）柱；阳离子交换层析（CEX）柱；0.45 μm注射器滤器；2 M咪唑（pH = 7.5）；可达到100,000 x g的超速离心机；可达到4,000 x g的高速台式离心机；离心过滤单元（10 KDa NMWL）；可在280 nm处读数的分光光度计；His6-烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶；以及具备混合两种缓冲液、将溶液上样至层析柱、实现梯度洗脱并收集层析柱洗脱组分功能的层析设备。
- 将昆虫细胞裂解液从透析袋中取出，在4,000 x g下离心10分钟以去除沉淀物。此时最终透析并澄清的样品通常仍略显浑浊，但无需进一步处理即可直接上样至后续的CEX柱。
- 用三倍柱体积（CV）的缓冲液G洗涤，再用三倍柱体积的缓冲液F洗涤，以制备20 mL阳离子交换柱（参见材料表）。
注意：尽管我们未对其他树脂进行系统评估，但多位同行发现使用SP Sepharose High Performance树脂以外的介质时分辨率较差。 - 通过加入20 mL缓冲液E，将20 mL透析后的样品稀释至终NaCl浓度为100 mM，并将稀释后的样品上样至阳离子交换柱。
- 当上一次稀释样品接近完成上样时，继续将按上述方法新鲜稀释的样品加入上样管中，持续上样。
注意：一次性将全部样品稀释至100 mM NaCl会导致目标蛋白因沉淀而显著损失。 - 用缓冲液F洗涤柱子至Abs280基线平衡，通常需要3倍柱体积。随后在400 mL（20 CV）从缓冲液F到65%缓冲液G的梯度洗脱中将蛋白洗下，并以6 mL组分收集（图1B）。
- 梯度洗脱完成后，继续用额外1.5倍柱体积（65%缓冲液G）洗涤柱子。
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结果
图1：蛋白质纯化过程的SDS-PAGE凝胶图。（A）来自裂解液的IMAC捕获。FNTA/B为迁移至约48 kDa处的深色条带，His6-MBP-tev-KRAS4b为迁移至约67 kDa处的深色条带。M = 蛋白质分子量标准；T = 总蛋白；L = 澄清裂解液/上柱样品；F = 穿流液。各组分以逐渐增加的咪唑浓度梯度洗脱。（B）CEX组分，标记1–5对应于洗脱峰中的主峰组分。（C）TEV酶切及第二次IMAC。C = TEV酶切前CEX步骤的合并组分；L = TEV酶切后上样样品。目标蛋白种类已标注。（D）最终KRAS4b-FMe蛋白...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.8 mL 安全锁扣管，本色 | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm 带盖不锈钢互锁式自动进样瓶 | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 5427R 离心机 | Eppendorf | ||
| 乙腈，HPLC 级 | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| 阳离子交换色谱柱（CEX） | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| Exactive Plus EMR 质谱仪 | Thermo Scientific | ||
| Gilson 7x14 mm 小瓶 | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| 高速/台式离心机 | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | 最高可达 4,000 ×g |
| His6-烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶 | Addgene | 92414 | 根据 Raran-Kurussi 等（2017）方法纯化：TEV 蛋白酶去除亲和标签。见：Burgess Brown N.（编）《大肠杆菌中异源基因表达》，《分子生物学方法》第 1586 卷，Humana Press，纽约 |
| 不含 EDTA 或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore Sigma | P8849 | |
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| 氩气 | Airgas | ARUP | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507-500MI | 使用试剂级或更高级别 |
| NGC 色谱系统 | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 色谱系统 |
| 带支架的脂质挤出装置套装 | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| 液氮 | Airgas | NI-DEWAR | |
| Ultra-15 离心过滤单元，10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES 膜 |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 离心过滤器 | Amicon | UFC501024 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima - L80K | 最高可达 100,000 ×g |
| CHAPS | Sigma | C3023 |
