阳离子交换层析:一种基于净表面电荷从昆虫细胞裂解物中分离靶重组蛋白的技术

摘要

来源:Agamasu， C. et al.全加工重组 KRAS4b:分离和表征法尼基化和甲基化蛋白。J. Vis. Exp.（2020 年）

该视频演示了从昆虫细胞蛋白裂解物中分离重组蛋白的阳离子交换色谱技术。

方案

1. 蛋白质纯化

1. 准备缓冲液 A-H，如表 1 所示。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 缓冲溶液 缓冲剂（均为 20 mM） 酸碱度 氯化钠 （mM） 咪唑 （mM） 氯化镁₂ TCEP 系列 一个 HEPES 系列 7,3 300 - 5 1 乙 HEPES 系列 7,3 300 35 5 1 丙 HEPES 系列 7,3 300 500 元 5 1 D MES 系统 6,0 200 元 - 5 1 E MES 系统 6,0 - - 5 1 F MES 系统 6,0 100 - 5 1 克 MES 系统 6,0 1000 - 5 1 H HEPES 系列 7,3 300 - 1 1

2. 准备纯化材料（参见材料表）:不含 EDTA 或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物;固定化金属亲和色谱 （IMAC） 色谱柱;阳离子交换色谱 （CEX） 色谱柱;0.45 μm 注射器过滤器;2 M 咪唑 （pH = 7.5）;超速离心机，分子量为 100,000 x g;高速台式离心机，分子量为 4,000 x g;离心过滤装置 （10 KDa NMWL）;能够在 280 nm 处读数的分光光度计;His6-烟草蚀刻病毒 （TEV） 蛋白酶;以及色谱仪器，能够混合两种缓冲溶液，将溶液施加到色谱柱上，从色谱柱产生梯度洗脱，并从色谱柱中收集馏分。
3. 从透析中取出昆虫细胞裂解物，并以 4,000 x g 离心 10 分钟以去除任何沉淀物。此时，最终透析澄清的样品通常仍然浑浊，但无需进一步处理即可应用于后续的 CEX 色谱柱。
4. 制备 20 mL 阳离子交换柱（参见材料表），先用 3 个 CV 的缓冲液 G 洗涤，然后用 3 个 CV 的缓冲液 F.
   注意:虽然我们没有仔细评估其他填料，但几位同事发现，使用 SP Sepharose High Performance 填料以外的填料时，分离度较差。
5. 加入 20 mL 缓冲液 E，将 20 mL 透析样品稀释至最终 NaCl 浓度为 100 mM，然后将稀释的样品上样至阳离子交换柱上。
将
6. 如上所述制备的新鲜稀释样品添加到上样管中，继续上样色谱柱，因为之前的稀释液已接近上样量的终点。
   注意:将整个样品一次稀释至 100 mM NaCl 会因沉淀而导致靶蛋白的显著损失。
7. 用缓冲液 F 洗涤色谱柱至基线 Abs280。这通常需要 3 CV。在 400 mL （20 CV） 梯度中，从缓冲液 F 向 65% 缓冲液 G 梯度中洗脱蛋白质，以 6 mL 馏分收集（图 1B）。
8. 梯度完成后，继续洗涤色谱柱，再洗涤 1.5 CV（65% 缓冲液 G）。

结果

图 1:纯化过程的 SDS-PAGE 凝胶。（A） 从裂解物中捕获 IMAC。FNTA/B 是在 ~48 kDa 处迁移的暗带，而 His6-MBP-tev-KRAS4b 是在 ~67 kDa 处迁移的暗带。M = 蛋白质分子量阶梯;T = 总蛋白;L = 澄清裂解物/柱上样量;F = 色谱柱流过量。用增加的咪唑浓度梯度洗脱馏分。（B） 标记为 1-5 的 CEX 馏分对应于洗脱峰的峰馏分。（C） TEV 消化和第二次 IMAC。C = 来自 CEX 步骤前 TEV 切割的池;L = TEV 切割后上样样品。对感兴趣的物种进行标记。（D） 1 μg 和 5 μg 的最终 KRAS4b-FMe 蛋白。所描绘的凝胶是多种生产的代表性结果。

材料