基于尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡：一种根据尺寸分离革兰氏阴性菌外膜囊泡异质群体的技术

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本文内容

摘要

来源：Collins, S. M.，等，利用尺寸排阻色谱法分析细菌外膜囊泡异质性。视频实验杂志（2021）。

在本视频中，我们演示一种技术——尺寸排阻色谱法，用于分离来源于细菌的异质性外膜囊泡（OMV）群体。这些囊泡为纳米级球形结构，可通过尺寸排阻色谱法根据其大小分离为大尺寸和小尺寸亚群。

方案

1. 缓冲液的配制

配制 ELISA 洗涤缓冲液时，将 3.94 g Tris-base、8.77 g NaCl 和 1 g 牛血清白蛋白（BSA）加入 1 L 去离子水（DI）中，再加入 500 µL 吐温-20（polysorbate-20）。用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.2。
配制封闭缓冲液时，将 3.94 g Tris-base、8.77 g NaCl 和 10 g BSA 加入 1 L 去离子水（DI）中，再加入 500 µL 吐温-20（polysorbate-20）。用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.2。
配制洗脱缓冲液（PBS）时，将 8.01 g NaCl、2.7 g KCl、1.42 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 加入 1 L 去离子水（DI）中。用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.4。
注意：可配制该缓冲液的 10 倍浓缩液，使用时根据需要以去离子水稀释。

2. 外膜囊泡样本的制备

将 A. actinomycetemcomitans 细胞培养至对数生长后期（600 nm 处的光密度为 0.7）。在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 10 分钟，重复两次，收集菌体沉淀。将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤。
使用截留分子量为 50 kDa 的滤膜浓缩无菌上清液。将浓缩后的溶液在 4 °C 条件下，以 105,000 × g 超速离心 30 分钟。
将沉淀物重悬于 PBS 中，并再次进行超速离心（105,000 × g，4 °C，30 分钟）。将最终沉淀物重悬于 2 mL PBS 中。

3. 装填 S-1000 柱

用玻璃搅拌棒将凝胶过滤介质原液混匀，并倒入玻璃瓶中，体积为填装层析柱所需体积的约1.5倍（约135 mL）。让凝胶珠静置至完全沉降，倾去上清液。用洗脱缓冲液重悬凝胶珠，使最终混合液中凝胶体积约占70%，缓冲液体积约占30%。在真空条件下对溶液进行脱气处理。
使用铁架台将玻璃层析柱垂直固定，并加入洗脱缓冲液润湿柱管内壁。排出缓冲液，直至柱内剩余约1 cm高的缓冲液液面。
避免产生气泡，小心地用移液器将凝胶珠缓慢加入层析柱中，直至填满至柱顶。在此过程中持续排出多余的缓冲液。注意在向柱顶添加更多凝胶珠时，切勿让已装入的凝胶珠完全沉降。最终装填的凝胶柱高度应距离柱上端储液部分底部约2 cm。

4. 上样并收集组分

在真空条件下对洗脱缓冲液进行脱气。用两倍柱体积（180 mL）的洗脱缓冲液清洗层析柱。
让剩余缓冲液完全进入层析柱。当缓冲液到达凝胶层顶部时，小心地将含有OMV（脂质浓度约为100 - 200 nmol/L）的2 mL样品通过移液枪加至凝胶表面，注意不要扰动柱顶的凝胶颗粒。让样品完全进入凝胶，即直至凝胶层上方无液体残留。
在凝胶柱顶部小心且缓慢地添加洗脱缓冲液。切勿扰动凝胶的顶层，以免导致样品稀释。
在柱下放置一个50 mL离心管并打开柱阀。收集前20 mL流出液。根据需要，小心地向柱顶补充额外的洗脱缓冲液，确保柱体始终不干燥。
在柱下放置一系列1.5 mL离心管。开启层析柱，依次收集每管1 mL的洗脱组分。在收集过程中，根据需要持续向柱顶添加洗脱缓冲液。重复此步骤直至收集完96个组分，然后停止层析柱。
注意：样品若需长期保存，应储存于-20 °C；短期保存则置于4 °C，直至进一步分析。
清洗层析柱时，先用一倍柱体积（90 mL）的0.1 M NaOH溶液过柱，再用两倍柱体积（180 mL）的洗脱缓冲液冲洗层析柱。

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材料

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