基于尺寸排阻色谱的细菌细胞外囊泡分离:一种根据大小分离革兰氏阴性细菌外膜囊泡异质群体的技术

摘要

来源:Collins， S. M.， et al.， 体积排阻色谱分析细菌外膜囊泡异质性。J. Vis. Exp.（2021 年）。

在本视频中，我们演示了一种技术——尺寸排阻色谱法——用于分离来自细菌的外膜囊泡或 OMV 的异质群体。这些囊泡是纳米级球形结构，通过尺寸排阻色谱根据其大小分为大亚群和小亚群。

方案

1. 缓冲液的准备

1. 要制备 ELISA 洗涤缓冲液，将 3.94 g Tris-碱、8.77 g NaCl 和 1 g 牛血清白蛋白 （BSA） 添加到 1 L 去离子 （DI） 水中。加入 500 μL 聚山梨酯-20。使用 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.2。
2. 要制备封闭缓冲液，请添加 3.94 g Tris 碱、8.77 g NaCl 和 10 g BSA。将 500 μL 聚山梨酯-20 加入 1 L 去离子水中。使用 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.2。
3. 要制备洗脱缓冲液 （PBS），将 8.01 g NaCl、2.7 g KCl、1.42 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 添加到 1 L 去离子水中。使用 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.4
   注意:可以制备该缓冲液的 10x 溶液，并根据需要用去离子水稀释。

2. OMV 样品的制备

1. 将 A. actinomycetemcomitans 细胞生长到晚期指数期（600 nm 处的光密度为 0.7）。通过在 4 °C 下以 10,000 x g 离心两次 10 分钟来沉淀细胞。通过 0.45 μm 过滤器过滤上清液。
2. 使用 50 kDa 分子量截止过滤器浓缩无菌上清液。在 4 °C 下以 105,000 x g 超速离心浓缩溶液 30 分钟。
将
3. 沉淀重悬于PBS中并再次超速离心（4°C下105,000 x g 30分钟）将沉淀重悬于 2 mL PBS 中。

3. 填充 S-1000 色谱柱

1. 将凝胶过滤培养基储备瓶与玻璃搅拌棒混合，倒入玻璃瓶中，倒出填充色谱柱所需的体积，加上大约 50% 的过量体积（约 135 mL）。让这些珠子静置直到它们沉淀下来，然后倒出多余的液体。将磁珠重悬于洗脱缓冲液中，使最终溶液为约 70%（按体积计）凝胶、30% 缓冲液。在真空下对溶液进行脱气。
2. 使用环形支架垂直安装玻璃柱，并填充洗脱缓冲液以润湿柱壁。排空缓冲液，直到色谱柱中只剩下约 1 cm 的缓冲液。
3. 在不产生气泡的情况下，小心地将微珠移液到色谱柱中，将色谱柱填充到顶部。在整个过程中继续排空多余的缓冲液。在将其他珠子添加到柱顶部之前，请确保不要让珠子完全沉淀。色谱柱应填充至色谱柱储液槽底部下方约 2 cm 的高度。

4. 加载样品并收集馏分

1. 在真空下对洗脱缓冲液进行脱气。用两种柱体积 （180 mL） 的洗脱缓冲液洗涤色谱柱。
2. 让剩余的缓冲液完全进入色谱柱。缓冲液到达凝胶层顶部后，小心地将含有 OMV（脂质浓度约为 100 - 200 nmol/L）的 2 mL 样品移液到磁珠表面，注意不要干扰柱子顶部的任何磁珠。让样品完全进入凝胶，即当凝胶层上方没有液体残留时。
3. 小心缓慢地在凝胶柱顶部加入洗脱缓冲液。请勿干扰凝胶的顶层，因为这会导致样品稀释。
4. 在色谱柱下方放置一根 50 mL 试管并打开色谱柱。收集前 20 mL 洗脱液。根据需要，小心地将额外的洗脱缓冲液添加到色谱柱顶部，以确保色谱柱永不干燥。
5. 在色谱柱下方放置一系列 1.5 mL 试管。启动色谱柱并在每个试管中收集一系列 1 mL 样品。在收集样品时，根据需要继续向色谱柱顶部添加洗脱缓冲液。重复直到收集到 96 个馏分。停止列.
   注意: 样品应在 -20 °C 下长期储存，或在 4 °C 下短期储存，直至进一步分析。
6. 要清洁色谱柱，请将一倍柱体积 （90 mL） 的 0.1 M NaOH 贯穿色谱柱。将两个柱体积 （180 mL） 的洗脱缓冲液穿过色谱柱。

材料