丁基依赖性疏水相互作用液相色谱：一种基于疏水相互作用表征抗体-药物偶联物的技术

摘要

来源：Oller-Salvia, B. 通过快速生物正交反应实现抗体-药物偶联物生成的非天然氨基酸遗传编码. 可视化学期刊 (2018).

本视频展示了基于疏水相互作用液相色谱对抗体-药物偶联物的表征方法。采用基于丁基配体的色谱柱对抗体-药物偶联物进行表征 通过 与配体的疏水相互作用。

方案

1. 抗体的制备与表征

1. 表达抗体
   1. 在250中解冻一管HEK悬浮细胞 mL 锥形瓶中加入 50 mL 表达培养基，培养基中添加 100 单位/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B。将细胞置于 37 °C、8% CO₂ 条件下培养₂ 在配备摇床（125 rpm）的加湿培养箱中培养。将细胞按 0.3–0.5 × 10⁶ 个/mL 传代⁶ 细胞/mL（每2-3天传代一次），转染前至少传代2次。
   2. 当密度达到2.5 × 10⁶ 当细胞密度达到 cells/mL（传代后 2–3 天）时，配制新鲜的 100 mM CypK 溶液。称取 64 mg CypK，加入 2.5 mL 0.1 M 氢氧化钠，涡旋混匀，离心以收集未溶解的颗粒，并进行超声处理。
   3. 将2.5 mL CypK（100 mM，溶于0.1 M NaOH）加入42.5 mL添加抗生素的表达培养基中。充分混匀，加入250 µL 0.1 M HCl，并用0.22 µm滤器过滤除菌。
   4. 稀释 50 µg HC 和 LC pKym1 质粒 用减血清培养基定容至2.5 mL。在另一管中，将135 µL转染试剂用减血清培养基稀释至2.5 mL。
   5. 溶液配制5分钟后，将质粒与转染试剂溶液混合，室温孵育20分钟，以使DNA与转染试剂形成复合物。
   6. 同时，离心1.25亿个细胞 在目标密度下培养5 500 × g 离心 1 分钟，用含有 CypK 的表达培养基重悬，并加入 DNA-转染试剂混合物。CypK 可按先前报道的方法购买或合成。
   7. 孵育细胞20小时后，加入试剂盒中提供的250 µL转染增强剂。
   8. 在加入CypK后6-7天从上清液中收集抗体（表达期间无需更换培养基）。
      *或者，为了获得更高且更一致的产量，可按照 Oller-Salvia 中所述方法构建稳定细胞系 等 2018年。在此情况下，曲妥珠单抗(CypK)₂ 通过在表达培养基中添加5 mM CypK即可实现表达。
2. 纯化抗体
   1. 离心细胞15分钟，离心力为3000 × g。
   2. 用0.45或0.22 µm滤器过滤上清液。若滤器堵塞，更换新的滤器并继续过滤。若仅数毫升后即发生堵塞，将上清液在7000 × g条件下额外离心15分钟。
   3. 在空的聚丙烯层析柱中加入蛋白A树脂（每100 mL上清液加2 mL），并用至少5倍柱体积的珠子洗涤缓冲液（0.1 M磷酸钠，150 mM NaCl）平衡树脂。
   4. 将上清液分装至两个50 mL离心管中，加入5倍体积的珠子洗涤缓冲液（0.5 M磷酸钠，150 mM NaCl），随后加入预平衡的蛋白A树脂。将离心管置于摇床上，室温孵育3小时，以沉淀上清液中的抗体。
   5. 或者：将上清液加至层析柱中，所用体积至少为推荐树脂体积的两倍，并让其自然流过。通过SDS-PAGE检测上清液中是否残留大量抗体。若仍有较多抗体残留，需将上清液再次通过树脂进行洗脱。
   6. 将蛋白A树脂与上清液一同转移至层析柱中，并让液体流过。
   7. 加入25 毫升洗涤缓冲液（或至少10个树脂体积） 并让其流过。
   8. 用 4 mL 的 0.1 M 柠檬酸钠（pH 3）从 1 mL 的 1 M 磷酸盐缓冲液（含 150 mM NaCl）中洗脱抗体。
   9. 用 10 稀释抗体 mL PBS，浓缩至0.5-1 通过离心过滤浓缩至 mL，并用 PBS 缓冲液置换缓冲体系三次。
   10. 使用疏水相互作用色谱丁基柱（butyl HIC column），以0.5 mL/min流速和低盐缓冲液0-100%梯度洗脱30 min，通过FPLC纯化样品 （50 mM 磷酸钠，pH 7.0，20% 异丙醇）的高盐缓冲液（1.5 M (NH₄)₂SO₄，50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0），5% 异丙醇）。收集所有洗脱组分，并在280 nm处监测洗脱情况。少量（< 1 mg）可以 在2.4节所述条件下，采用HPLC-HIC纯化，以最大化得率和纯度。
   11. 合并含有抗体的组分，用 PBS 稀释至至少 4 mL，然后浓缩 通过离心过滤，并用 PBS 缓冲液置换缓冲体系三次。
3. 定量抗体
   1. 使用微量分光光度计在280 nm处测量吸光度，以获得近似浓度。
   2. 如果需要精确测量，请使用ELISA试剂盒检测人IgG。若仅需粗略估计，则按以下步骤使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE进行分析：
      1. 通过将浓度为 1 mg/mL 的曲妥珠单抗标准品（经 ELISA 定量）连续六次两倍稀释，制备标准品。
      2. 将标准品和样品在还原性上样缓冲液中煮沸，浓度约为 0.25 mg/mL。
      3. 使用 MES-SDS 缓冲液在 4–12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶上电泳分离，然后用考马斯亮蓝类染料染色。最后，使用 ImageJ 测量对应轻链或重链条带的颜色密度，并根据标准曲线对样品信号进行插值计算。
4. 将抗体在 4 °C 下保存。

2. 抗体偶联及抗体药物偶联物（ADC）的表征

1. 将抗体与含四嗪的分子进行偶联
   1. 将10摩尔当量的四嗪-vcMMAE（4 µL，3.4 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO））用20 µL乙腈和76 µL磷酸盐缓冲液（PBS）在小型锥形管中稀释例如，PCR管）
   2. 加入1摩尔当量的trastuzumab(CypK)₂ （100 µL，2 mg/mL，溶于PBS中），充分混匀，在室温（25 °C）下反应3小时，生成曲妥珠单抗（MMAE）₂.
      注意： 其他分子（如四嗪-5-TAMRA）可按照本方案连接至抗体，以替代四嗪-vcMMAE。
2. 纯化抗体药物偶联物（ADC）
   1. 按照制造商说明，用 PBS 预先平衡尺寸排阻旋转柱。
   2. 将全部反应液体积加入离心柱中，于1500 × g离心1分钟。
3. 定量测定ADC并通过对SDS-PAGE分析偶联物
   1. 按照1.3.2节所述方法，使用未修饰抗体建立标准曲线，通过测定SDS-PAGE中轻链的颜色密度来定量ADC。
   2. 重链应出现轻微迁移，表明偶联后分子量有所增加。
      注意：如果抗体经荧光染料修饰，例如曲妥珠单抗(TAMRA)₂只有与重链相对应的条带应在染色前显示凝胶内荧光。
4. 通过HPLC-HIC分析偶联物
   1. 用100%缓冲液A（1.5 M (NH₄)₂SO₄，50 mM磷酸钠，pH 7.0）平衡HPLC-HIC柱₄)₂SO₄，50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）、5% 异丙醇中孵育 5 分钟。
   2. 将15 µL（67 pmol）浓度为1 mg/mL的trastuzumab(CypK)2溶液与15 µL 2倍浓度的缓冲液A在样品瓶中混合。随后在高效液相色谱仪中设定10 µL的进样量。
   3. 以1 mL/min的等度流速用100%缓冲液A洗脱1分钟，随后进行15分钟的梯度洗脱，缓冲液A在缓冲液B中的比例从100%降至0%（缓冲液B为50 mM磷酸钠，pH 7.0，含20%异丙醇）。在280 nm处监测洗脱过程。
   4. 通过积分对应于各物种的峰，并将所得峰面积代入以下公式来计算 DAR：
      DAR = (1 × 曲妥珠单抗(MMAE) + 2 × 曲妥珠单抗(MMAE)₂)
      /(曲妥珠单抗(MMAE)₀ + 曲妥珠单抗(MMAE)₁ + 曲妥珠单抗(MMAE)₂)
      曲妥珠单抗(CypK)的预期保留时间₂ 为7.5-8.0分钟，trastuzumab(CypK, MMAE)为9.1-9.6分钟，trastuzumab(MMAE)₂ 为10.5-11.0分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Expi293F	ThermoFisher Scientific	A14527	HEK 悬浮细胞
Expi293 表达培养基	ThermoFisher Scientific	A1435101	表达培养基
抗生素-抗真菌剂	ThermoFisher Scientific	15240062	青霉素-链霉素-两性霉素 B
125 mL 聚碳酸酯锥形瓶，带通气盖	Corning	431143	摇瓶
Brunswick S41i 培养箱	Eppendorf	S41I230011	带摇床的 CO₂ 培养箱
氢氧化钠 4 mol/L (4 N) 水溶液	VWR	191373M
环丙烯赖氨酸	Sichem	SC-8017	本研究中按照 Elliot 等人 2014 年所述方法合成
Steriflip-GP，0.22 µm，聚醚砜，经伽马射线辐照灭菌	Merck Millipore	SCGP00525
Opti-MEM 低血清培养基	ThermoFisher Scientific	31985070	低血清培养基
ExpiFectamine 293 转染试剂盒	ThermoFisher Scientific	A14525	转染试剂
5810 R 离心机	Eppendorf	5811000460
Millex-GP 注射器滤器，0.22 µm，聚醚砜，33 mm，经伽马射线灭菌	Merck Millipore	SLGP033RS
Protein A 树脂	Sino Biological	10600-P07E-RN-25
Poly-Prep 层析柱，每包 50 根	Bio-Rad	7311550	聚丙烯层析柱
Econo-Column 漏斗	Bio-Rad	7310003
柠檬酸钠	Fluka	71635
ÄKTA explorer FPLC	GE Healthcare
HiTrap HIC 筛选试剂盒	GE Healthcare	28-4110-07	包含 1 mL HiTrap Butyl HP 柱
硫酸铵	VWR	2133.296
异丙醇	Honywell	34863-2.5L
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
四嗪-vcMMAE	ChemPartner	-	定制合成
四嗪-5-TAMRA	Jena Bioscience	CLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶，1.0 mm × 10 孔	ThermoFisherScientific	NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell	ThermoFisherScientific	EI0001
UltiMate 3000 HPLC	ThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac HIC-20，4.6 × 100 mm，5 µm	ThermoFisherScientific	88553
NanoAcquity	Waters
人血清	Sigma-Aldrich	H4522-20mL
CO₂ 培养箱	Panasonic
单甲基奥瑞他汀 E	Cayman Chemical	16267
NanoDrop 2000	ThermoFisherScientific		微量分光光度计
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	基于考马斯亮蓝的染色剂
50 mL 管，114×28 mm，聚丙烯	Sarstedt	62.547.254	锥形管
Amicon Ultra-15 离心过滤单元，50,000 NMWL	Merck	UFC905024	离心过滤浓缩管（Protein A 沉淀后使用）
Amicon Ultra-4 离心过滤单元，50,000 NMWL	Merck	UFC805024	离心过滤浓缩管（FPLC 或 HPLC 纯化后使用）
Zeba 脱盐离心柱，7K MWCO，0.5 mL	ThermoFisherScientific	89882	尺寸排阻离心柱
PCR 管 0.2 mL 平盖	Thistle Scientific Ltd	AX-PCR-02-C-CS	PCR 管