荧光检测尺寸排阻色谱法：一种用于鉴定去垢剂溶解后荧光标记膜蛋白完整性的技术

摘要

来源：Bird, L. E., 等 基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌. 视频期刊杂志 (2015)

在本视频中，我们演示了一种荧光检测尺寸排阻色谱技术，用于在去垢剂溶解后筛选大肠杆菌（Escherichia coli）中绿色荧光蛋白（GFP）融合膜蛋白的稳定性。在尺寸排阻色谱图中呈现对称峰形且游离GFP极少或没有的蛋白，表明其降解和聚集程度最低，适合进一步用于结构与功能分析。

方案

1. 膜组分的溶解与分析

1. 解冻膜组分（如有必要），针对每种用于溶解的去垢剂，将900 μl膜悬液分装至1.5 ml聚烯烃微量离心管中。
2. 向指定的1.5 ml管中加入100 μl新配制的去垢剂（10% w/v的DDM、DM、Cymal-6和LDAO溶液），使终浓度为1%。在溶解真核生物膜蛋白时，可在去垢剂中添加胆固醇半琥珀酸酯（终浓度0.2%）。
3. 在4 °C下轻轻振荡孵育混合物1小时。
4. 使用台式超速离心机，在4 °C、150,000 g条件下离心45分钟，沉淀去垢剂不溶组分，离心时确保离心管至少半满，并保留上清液。
   注意：可通过荧光酶标仪检测溶解后膜蛋白的GFP荧光强度，并将去垢剂不溶组分重悬于相同体积的PBS中进行比较，从而评估去垢剂的溶解效果。
5. 采用荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）分析不同去垢剂与膜蛋白形成的复合物的单分散性。
6. 进行FSEC分析时，使用具有宽分离范围（例如分子量5,000至5,000,000）的尺寸排阻柱，并以洗脱缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.03% DDM）在0.3 ml/min流速下平衡色谱柱。所有样品均使用该缓冲液，即不随测试的去垢剂更换缓冲液。
7. 以0.3 ml/min流速将100 μl溶解后的膜样品注入色谱柱，通过荧光检测器监测洗脱曲线（激发波长488 nm，发射波长512 nm）。若无在线荧光检测器，可收集各洗脱组分并在酶标仪中测定其荧光强度。
8. 将洗脱体积与荧光强度数据导入电子表格软件进行图形化展示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胆固醇半琥珀酸酯	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6（6-环己基-1-己基-βD-麦芽糖苷）	Anatrace	C326
DDM（正十二烷基-β-麦芽糖苷）	Generon	D97002
DM（正癸基-β-麦芽糖苷）	Generon	D99003
LDAO（N,N-二甲基十二胺-N-氧化物）	Generon	D71111
BenchMark 荧光蛋白标准品	Life Technologies	LC5928
配备 45-Ti 转子的 Optima L-100 超速离心机	Beckman Coulter	393253
配备 TLA-55 转子的 Optima Max-XP 超速离心机	Beckman Coulter	393315
配备 RF-20A 荧光检测器的 Prominence UFLC 系统	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL 尺寸排阻色谱柱	GE Healthcare	17-5172-01