荧光检测尺寸排阻色谱法:一种在去污剂溶解后鉴定荧光膜蛋白完整性的技术

Abstract

来源:Bird， L. E.， et al. Green 基于荧光蛋白的大肠杆菌膜蛋白表达筛选。J. Vis. Exp. （2015 年）

在本视频中，我们演示了一种荧光检测尺寸排阻色谱技术，用于筛选去污剂溶解后大肠杆菌中绿色荧光蛋白 （GFP） 融合膜蛋白的稳定性。在尺寸排阻谱中表现出对称峰且游离 GFP 很少或没有的蛋白质表明纯化的蛋白质具有最小的降解和聚集，随后可以选择这些蛋白质进行结构-功能分析。

Protocol

1.膜组分的溶解和分析

1. 解冻膜组分（如有必要），对于用于增溶的每种去污剂，将 900 μl 膜悬浮液分装到 1.5 ml 多聚体微量离心管中。
2. 将 100 μl 每种新鲜制备的洗涤剂（DDM、DM、Cymal-6 和 LDAO 的 10% w/v 溶液）加入指定的 1.5 ml 试管中，终浓度为 1%。为了溶解真核膜蛋白，可以将半琥珀酸胆固醇（0.2% 终浓度）添加到去污剂中。
3. 将混合物在 4 °C 下孵育 1 小时，同时轻轻搅拌。
4. 用台式超速离心机沉淀洗涤剂不溶性级分，确保试管至少半满，在 4 °C 下以 150,000 g 沉淀 45 分钟并保留上清液><。 注意:使用荧光读板器可以通过测量溶解膜的 GFP 荧光来估计去污剂溶解的有效性，其中去污剂不溶性部分重悬于相同体积的 PBS 中。
5. 使用荧光检测的尺寸排阻色谱 （FSEC） 分析不同去污剂的单分散性:膜蛋白复合物。
6. 对于 FSEC 分析，用流速为 0.3 ml/min 的电泳缓冲液（20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、0.03% DDM）平衡分子量范围宽的体积排阻柱，例如分子量为 5,000 至 5,000,000 的体积排阻柱。该缓冲液适用于所有样品，即，对于测试的每种去污剂，它不会改变。
7. 以 0.3 ml/min 的流速将 100 μl 溶解膜注入色谱柱上。使用荧光光学（488 nm 激发和 512 nm 发射）监测洗脱曲线。如果没有在线荧光监测器，请收集馏分并在读板器中读取荧光。
8. 将洗脱体积和荧光强度数据导入电子表格程序中，以便以图形方式显示。

Materials