基于DFE的亲和层析：利用高离子强度洗脱条件从粗样品中纯化2F5单克隆抗体的技术

摘要

来源：Knödler, M. 等，用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种利用DsRed-2F5-表位或DFE配体纯化2F5单克隆抗体的亲和层析技术。纯化的2F5单克隆抗体是免疫治疗中的重要药物。

方案

1. 检测从澄清的植物提取物中纯化单克隆抗体的效果

1. 制备含有2F55的100 mL澄清植物提取物，或来自优选的细胞表达系统的上清液，其中也含有2F5。
2. 配制平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，pH 7.4）、低pH洗脱缓冲液（0.05 M 柠檬酸，0.05 M 氯化钠，pH 4.0–3.25）和高离子强度洗脱缓冲液（1.0–4.0 M 氯化镁，0.1 M HEPES，pH 8.0）
3. 用缓冲液冲洗色谱系统。安装 DFE 亲和柱（参见主实验方案正文) 在色谱系统上进行，并以1.0 mL/min的流速用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡^-1监测280 nm处的紫外吸收。
   注意： 上样植物提取物或细胞培养上清液可能导致柱压升高。请设置0.2 MPa的高压警报，以避免对层析系统或DFE柱造成损坏。
4. 加入80 mL澄清的植物提取液或上清液（步骤 1.1以0.5 mL min⁻¹的流速将样品加载到柱上，确保接触时间为2 min。以2 mL为一份收集穿流组分，用于穿透曲线的重建。若无法立即进行样品分析，将穿流组分在4 °C下保存。
5. 用6个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。在此步骤的开始、中间和结束时分别收集洗涤液样品。
6. 用5个柱体积的低pH洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES，1.25 M 氯化镁，pH 8.0）洗脱mAb 2F5。当UV 280 nm信号上升至基线以上5 mAU时，收集DFE组分。
   1. 针对每种表位-抗体组合优化洗脱缓冲液。对于2F5，1.25 M氯化镁在产物回收率与配体稳定性之间实现了最佳平衡。
      注意： 氯化镁溶液易产生沉淀。因此，先将氯化镁溶于约700 mL水中。另取100 mL水溶解HEPES，并调节pH至8.0。将溶解后的氯化镁溶液加入HEPES溶液中，再加水至终体积1.0 L。溶解氯化镁后不可调节pH，否则会导致沉淀生成。
7. 使用Bradford法、十二烷基硫酸锂-聚丙烯酰胺凝胶电泳（LDSPAGE）和表面等离子体共振（SPR）光谱法分析1.4–1.6步骤中采集的所有样品。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	标准品
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	层析柱
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	缓冲液组分
氯化镁	Carl Roth GmbH	KK36.2	缓冲液组分
PH 3110	WTW	2AA110	pH计
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	层析树脂
氯化钠	Carl Roth GmbH	P029.2	缓冲液组分
柠檬酸钠	Carl Roth GmbH	HN13.2	缓冲液组分