基于 DFE 的亲和层析:一种使用基于高离子强度的洗脱条件从粗样品中纯化 2F5 单克隆抗体的技术

Abstract

来源:Knödler， M. et al.， 活化交联琼脂糖用于亲和层析树脂的快速开发 - 抗体捕获作为案例研究。J. Vis. Exp.（2019 年）。

该视频介绍了一种使用 DsRed-2F5-表位或 DFE 配体纯化 2F5 单克隆抗体的亲和层析技术。纯化的 2F5 单克隆抗体是免疫治疗中必不可少的药物。

Protocol

1. 检测澄清植物提取物中 mAb 的纯化

1. 制备 100 mL 含有 2F55 的澄清植物提取物或来自首选的基于细胞的表达系统的上清液，也含有 2F5。
2. 制备平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠、500 mM 氯化钠，pH 7.4）、低 pH 值洗脱缓冲液（0.05 M 柠檬酸盐、0.05 M 氯化钠，pH 4.0–3.25）和高离子强度洗脱缓冲液（1.0–4.0 M 氯化镁，0.1 M HEPES，pH 8.0）
3. 用缓冲液冲洗色谱系统。在色谱系统上安装 DFE 亲和柱（请参阅主要方案文本），并用 5 CV 的平衡缓冲液以 1.0 mL ^min-1 的流速平衡。监测 280 nm 处的紫外吸光度><。 注意: 将植物提取物或细胞培养上清液上样到色谱柱上会导致背压增加。将高压警报设置为 0.2 MPa，以避免损坏色谱系统或 DFE 色谱柱。
以
4. 0.5 mL min-1 的流速将 80 mL 澄清的植物提取物或上清液（步骤 1.1）加载到色谱柱上，以保证 2 分钟的接触时间。以 2 mL 级分收集流出样品，用于穿透曲线重建。如果无法立即进行样品分析，请将流通样品储存在 4 °C 下。
5. 用 6 CV 的平衡缓冲液洗涤色谱柱。在此步骤的开始、中间和结束时收集洗涤液样品。
6. 用 5 CV 的低 pH 值洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES、1.25 M 氯化镁，pH 8.0）洗脱 mAb 2F5。当 UV 280 nm 信号增加到基线以上 5 mAU 时，收集 DFE 分数。
   1. 优化每个表位-抗体对的洗脱缓冲液。对于 2F5,1.25 M 氯化镁在产物回收率和配体稳定性之间实现了最佳平衡><。 注意: 氯化镁溶液易沉淀。因此，将氯化镁溶解在 ~700 mL 水中。将 HEPES 分别溶解在 100 mL 水中，并将 pH 值调节至 8.0。将溶解的氯化镁溶液添加到 HEPES 溶液中，并加水至最终体积为 1.0 L。溶解氯化镁后不要调节 pH 值，因为这会导致沉淀。
7. 使用 Bradford 方法、十二烷基硫酸锂-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （LDSPAGE） 和表面等离子体共振 （SPR） 光谱分析步骤 1.4-1.6 中采集的所有样品。

Materials