基于薄层色谱的酶活性检测法：利用薄层色谱测定体外焦磷酸激酶活性的技术

摘要

来源：Pokhrel, A., 等 A 纯化与 体外 (p)ppGpp合成酶活性检测 艰难梭菌. 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种基于薄层色谱的酶活性测定方法，通过使用放射性标记的核苷酸来检测焦磷酸激酶活性。该方法可深入了解核苷酸合成及磷酸转移反应。

方案

1. 通过薄层色谱法测定蛋白质活性

1. 制备薄层色谱（TLC）板。
   1. 通过去离子水清洗制备聚乙烯亚胺（PEI）-纤维素板。将板放入玻璃层析缸中，加入双蒸水至深度约0.5 cm。
   2. 让水迁移至板的顶端。
      注意：清洗板并非绝对必要，因为板也可直接使用，但清洗可提高最终图像的清晰度。在两个相互垂直的方向上清洗板可进一步确保树脂中的任何污染物被隔离在板的一个角落（图1）。
   3. 将板从玻璃层析缸中取出，置于实验台架上过夜干燥（12–18 h）。
   4. 用软铅笔在干燥的板边缘2.0 cm处做标记，以指示TLC点样位置。对于2 μL样品，点样间距不得小于1.0 cm（图1）。
      注意：这可确保相邻斑点之间有清晰的分离，对信号定量至关重要。只要不划伤纤维素树脂，表面的小铅笔标记不会干扰溶剂迁移。
   5. 设计实验时，始终在每块板上保留一个未使用的点位。
      注意：这将提供一个空白泳道用于样品定量（图1）。一块20 cm的TLC板可容纳19个点位。
2. 酶活性测定
   1. 配制5倍缓冲液混合物，包含50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、25 mM 醋酸铵、10 mM KCl、1 mM DTT和0.6 mM ATP（三磷酸腺苷）。
      注意：该混合液可大量配制，并分装为10 μL等份冷冻保存以备后续使用。避免反复冻融。
   2. 配制单个反应体系，包含3 μM RSH（Rel/Spo同源酶）、1倍缓冲液混合物、0.6 mM GDP（二磷酸鸟苷）、1.2 mM MgCl₂。每10 μL反应体系中加入1.0 μCi的γ-³²P-ATP（放射性标记ATP），并用无核酸酶水补足至所需体积。在其他组分混合后再加入RSH，因为RSH加入含核苷酸的混合液会启动酶活性测定。
      注意：最终反应体积取决于采样时间点的数量。若每个时间点取样2 μL，则每4个时间点需配制10 μL反应混合液。
   3. 为控制因污染性核酸酶活性导致的ATP水解，配制一个不含蛋白的10 μL反应体系并平行孵育。在t = 0和实验结束时各取2 μL点样，以确认在无蛋白条件下ATP未发生水解。
   4. 在加入RSH后立即取出2 μL样品，点样至已标记的PEI-纤维素板上，作为t = 0 min样品。
   5. 将反应体系在37 °C孵育，并在预定时间点取出2 μL等份样品。
      注意：当样品吸附到纤维素板上时，酶活性即停止。在最后一次点样后，需等待10–30分钟再进行展开，以确保样品完全吸附并干燥。
3. 薄层色谱
   1. 向层析缸中加入1.5 M KH₂PO₄（pH 3.64）至深度0.5 cm。
      注意：所需体积取决于层析槽的尺寸。任何底部平整、宽度足以插入TLC板而不弯曲的玻璃容器均可作为展开槽，只需加盖即可。TLC板可用洁净剃刀片切割成较窄条带，以便在覆盖塑料膜的玻璃烧杯中展开。
   2. 将板底边浸入溶剂中。让溶剂迁移至板顶端（约90分钟）。
      注意：虽然溶剂迁移至板顶端后会停止，且长时间浸泡不会导致样品丢失或跑偏，但不应将板在溶剂中过夜浸泡。浸泡超过4小时可能导致树脂从板基底脱落，造成信号丢失。
   3. 将板从层析槽中取出，放置在实验台干燥架上。
   4. 让板在空气中过夜干燥。
      注意：可使用吹风机加速干燥。干燥程度可通过树脂颜色判断：湿润时颜色变深，完全干燥后恢复至未使用板的颜色。
   5. 板干燥后，用塑料膜包裹，以防止放射性物质转移到成像暗盒中，然后进行放射自显影分析（图2）。
4. 数据分析
   1. 将含有分离反应产物的PEI-纤维素板在室温下暴露于磷屏成像暗盒中4小时。
      注意：使用新鲜γ-³²P-ATP的指定浓度时，此曝光时间足以获得非常清晰的图像。若使用较少的放射性标记底物，可将曝光时间延长至12–16小时。
   2. 在磷屏成像仪上扫描暗盒。
   3. 使用具有图形用户界面的成像软件，选择绘制矩形功能，用鼠标围绕一个完整泳道及其内部的ATP和ppGpp（四磷酸鸟苷）斑点绘制矩形感兴趣区域（ROI）（图2）。
   4. 使用选择、复制和粘贴命令（或所用成像软件对应的命令），在其他泳道中绘制相同的ROI，以确保各泳道中ROI测量的区域完全一致。包含一个未使用泳道的ROI作为空白对照。
   5. 使用成像软件的分析 | 工具 | ROI管理器 | 添加命令，选中PEI纤维素板上所有绘制的ROI。
   6. 使用分析 | 设置测量 | 测量命令，量化每个ROI内的信号强度，并将测量结果导出为电子表格（图2）。从实验信号中减去空白ROI值。
      
   7. 使用公式计算每个泳道中经空白校正后的信号有多少百分比归因于ATP和ppGpp。
      注意：ROI的绘制与定量可使用与磷屏成像仪兼容的商业软件，或免费的ImageJ软件（美国国立卫生研究院）完成。

结果

图1：TLC板的制备。（A）将板的一边底端浸入水中（蓝色），沿一个方向进行清洗。污染物（黄色）随溶剂迁移至板的顶端。（B）待板完全干燥后，将其相对于第一次清洗方向旋转90°，再进行第二次清洗，再次使水迁移至板的顶端。（C）清洗后，所有污染物被集中于板的一个角落。清洗后的TLC板上的固定相可用软铅笔轻轻标记，以指示样品点样位置。对于2 μL的样品，点样点之间至少保持1 cm的距离，以确保样品充分分离。样品点样位置应距离板的“底端”2 cm。点样完成后，让溶剂向上迁移至“顶端”，此时任何污染物均已被水洗步骤隔离。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
薄层色谱（TLC）展开槽	General Glass Blowing Company	80-3
聚乙烯亚胺（PEI）-纤维素板（20 cm × 20 cm，100 μm 厚度），带聚酯支持膜	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10 mCi/ml 铅，100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
腺苷-5’-三磷酸（ATP）100 mM	Bio Basic Canada	AB0311
鸟苷-5’-二磷酸二钠盐（GDP）	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
储存磷屏	GE Healthcare Life Sciences	BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 磷光成像仪	GE Healthcare Life Sciences	-