基于薄层色谱的酶活性测定:一种使用薄层色谱法测定体外焦磷酸激酶活性的技术

摘要

来源:Pokhrel， A. 等人。艰难梭菌 （p） ppGpp 合成酶的 纯化和体外活性测定。J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了一种基于薄层色谱的酶测定法，用于使用放射性标记核苷酸测定焦磷酸激酶活性。该方法提供了对核苷酸合成和磷酸转移反应的见解。

方案

1. 通过薄层色谱法测定蛋白质活性

1. 准备薄层色谱 （TLC） 板。
   1. 通过在去离子水中洗涤来制备聚乙烯亚胺 （PEI） - 纤维素板。将板放入装有双蒸水的玻璃室中，深度为 ~0.5 cm。
   2. 让水迁移到板的顶部。
      注意:清洗印版并非绝对必要，因为可以在没有印版的情况下使用印版，但洗涤确实可以提高所得图像的清晰度。沿两个垂直方向清洗板可进一步确保树脂中存在的任何污染物被隔离在板的一个角落（图 1）。
   将
   3. 板从玻璃室中取出，放在台式架上晾干过夜（12-18 小时）。
   4. 用软铅笔在距一侧边缘 2.0 cm 处标记干燥板，以指示样品将应用于 TLC 的位置。对于 2 μL 样品，应用样品时，间隔不小于 1.0 cm（图 1）
      注:这允许在相邻点之间实现清晰分离，这对于信号量化至关重要。只要纤维素树脂不被划伤，表面的小铅笔痕迹就不会干扰溶剂迁移。
   5. 在计划实验时，请始终在每个板上留出一个未使用的位置。
      注:这将为样品定量提供一个空白泳道（图 1）。一个 20 厘米的 TLC 板将有 19 个位置的空间。
2. 酶活性测定
   1. 制备含有 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）、25 mM 乙酸铵、10 mM KCl、1 mM DTT 和 0.6 mM ATP（三磷酸腺苷）的 5x 缓冲液混合物><。 注:该混合物可以大量制备，并以 10 μL 等分试样冷冻以备后用。不要对混合物进行多次冻融循环。
   2. 准备含有 3 μM RSH（Rel/Spo 同源酶）、1x 缓冲液混合物、0.6 mM GDP（鸟苷二磷酸）、1.2 mM MgCl₂ 的单个反应。每 10 μL 反应加入 1.0 μCi 的 ^γ-32P-ATP（放射性标记的 ATP），并使用不含核酸酶的水使反应达到所需体积。在其他组分混合后添加 RSH，因为将 RSH 添加到含核苷酸的混合物中会启动酶活性测定。
      注:最终反应体积将取决于采样的时间点数量。要对 2 μL/时间点进行采样，则每 4 个时间点组装 10 μL 反应混合物。
   3. 为了控制 ATP 水解对核酸酶活性的污染，组装不含蛋白质的 10 μL 反应体系并平行孵育。在 t = 0 时和实验结束时点样 2 μL 样品，以确保 ATP 在不存在蛋白质的情况下未水解。
   4. 添加 RSH 后，立即取出 2 μL 并将其作为 t = 0 min 样品点样到标记的 PEI-纤维素板上。
   5. 在 37 °C 下孵育反应，在所需时间点去除 2 μL 等分试样。
      注:当样品吸附到纤维素板上时，酶活性将停止。将最后一个点添加到板中后等待 10-30 分钟，然后再显影，以确保完全吸附和样品干燥。
3. 薄层色谱法
   1. 用 1.5 M 1.5 M KH₂PO₄ （pH 3.64） 填充色谱室，深度为 0.5 cm
      注:所需的体积取决于色谱槽的尺寸。任何具有水平底部且足够宽以允许插入 TLC 板而不弯曲的玻璃容器都可以用作显影槽，并添加盖子。TLC 板可以用干净的剃须刀切成较窄的条状，以便在覆盖有塑料薄膜的玻璃烧杯中显影。
   2. 将板的底部边缘浸入溶剂中。让溶剂迁移到板的顶部（~90 分钟）。
      注:虽然溶剂迁移将在板顶部停止，并且样品在较长时间的浸泡过程中不会丢失或一起运行，但不应将板在溶剂中过夜。浸泡时间超过 4 小时会导致树脂从板背衬上脱落并导致信号丢失。
   3. 从色谱槽中取出板并将其放在台式晾衣架上。
   4. 让板风干过夜。
      注意:使用吹风机可以加速干燥。干燥度可以通过树脂的颜色来评估，树脂在潮湿时会变暗，完全干燥时会恢复到未使用的印版的颜色。
   5. 板干燥后，用塑料薄膜包裹板，以避免放射性物质转移到成像盒上，并通过放射自显影进行分析（图 2）。
4. 数据分析
   1. 将含有分离反应的 PEI-纤维素板在室温下暴露于磷光成像仪盒中 4 小时><。 注意:这足以使用指定浓度的新鲜 ^γ-32P-ATP 产生非常清晰的图像。如果使用较少量的放射性标记底物，则曝光时间可以增加到 12-16 小时。
   2. 在磷光成像仪上对暗盒进行成像。
   3. 使用带有图形用户界面的成像软件，通过选择绘制矩形并使用鼠标围绕整个泳道以及该泳道中包含的 ATP 和 ppGpp（鸟苷四磷酸）点绘制矩形 ROI 来绘制感兴趣区域 （ROI）（图 2）。
   4. 使用"选择"、"复制"和"粘贴"命令（或基于所用成像软件的相应命令）在其他通道内绘制相同的 ROI，以确保 ROI 在每个通道的相同区域内测量信号。包括来自未使用通道的 ROI，以用作空白。
   5. 使用 Analyze |工具 |ROI 经理 |添加成像软件的命令，选择在 PEI 纤维素板上绘制的所有 ROI。
   6. 使用 Analyze |设置测量 |测量命令，量化每个 ROI 内的信号强度，并将测量值导出为电子表格（图 2）。从实验信号中减去空白 ROI 值。
      
   7. 使用以下公式计算每个泳道内可归因于 ATP 和 ppGpp 的消隐信号的百分比。
      注意:可以使用与磷光成像仪兼容的商业软件或免费提供的 ImageJ 软件（美国国立卫生研究院）来绘制和量化 ROI。

结果

图 1:TLC 板的准备。（A） 将底边放入水中（蓝色）对板进行单维清洗。污染物（黄色）与溶剂一起迁移到板的顶部。（B） 印版完全干燥后，将其相对于第一次洗涤旋转 90°，然后再次让水迁移到印版顶部，进行第二维洗涤。（C） 洗涤后，任何污染物都被隔离在板的一个角落。可以用软铅笔轻轻标记洗涤过的 TLC 板的树脂，以指示应点样的位置。对于 2 μL 样品，点之间至少保持 1 cm 的距离可确保样品充分分离。在距离板的"底部"2 cm 处点样样品。上样后，让溶剂流到"顶部"，在那里任何污染物都将被水清洗隔离。

图 2:信号量化。定...

材料