高效薄层色谱法:一种从中性粒细胞中初步分离和定量脂质的技术

Abstract

来源:Brogden， G. 等人<a href="https://www.jove.com/v/54667">研究中性粒细胞脂质改变和随后形成中性粒细胞胞外陷阱的方法。J. Vis. Exp.（2017 年）。

该视频演示了一种从人外周血来源的中性粒细胞中初步分离和定量脂质的技术。该技术有助于在进行 HPLC 之前对目标分析物进行初步评估。

Protocol

1. 高效薄层色谱法 （HPTLC） 可半定量多种脂质的含量，包括胆固醇、磷脂和鞘磷脂

1. 制备以下四种电泳液和染色液。
   1. 解决方案 1:混合乙酸乙酯 （26.6%）、1-丙醇 （26.6%）、氯仿 （26.6%）、甲醇 （26.6%） 和氯化钾 （9.6%）。通过将 0.25 g KCl 溶解在 100 mL HPLC 级水中来制备 KCl。
   2. 解决方案 2:混合正己烷 （73%）、乙醚 （23%） 和柠檬酸 （2%）。
   3. 溶液 3:100% 正己烷。
   4. 将蒸馏水 （90 mL） 与 7.5 g 硫酸铜混合，然后加入 10 mL 磷酸，制备染色液。
2. 在单独的玻璃室中填充最多 5 mm 的每种溶液。添加任何种类的滤纸以提高每个腔室的运行速度。
3. 在第一种运行溶液中预孵育 20 x 10 cm HPTLC 硅胶 60 玻璃板，直到运行溶液到达板的顶部。然后在 110 °C 下干燥 10 分钟。
   注意:这些板可以储存在铝箔中以备将来使用，并在使用前在 110 °C 下干燥 10 分钟。
将从
4. 人外周血衍生的中性粒细胞获得的脂质沉淀溶解在 200 μL 氯仿/甲醇 （1:1） 溶液中，并在 37 °C 下孵育 15 分钟以溶解。
5. 使用尺子和软铅笔标记所需样品数量的上样点，以及至少一个标准品。对于第一种和第二种跑步解决方案，分别在大约 4 厘米和 6 厘米处标记跑步距离。
6. 上样时，在上样每个新样品之前，用氯仿/甲醇 （1:1） 洗涤 10 μL 注射器 3 次。每个样品逐滴加载 10 μL，尝试将样品集中在尽可能小的区域。样本应至少一式两份加载。
7. 将板垂直放入运行溶液 1 的第一个腔室中（步骤 1.1.1）。确保板平行于玻璃室壁，以实现均匀的迁移速度。
8. 溶剂管路到达第一个标记后，取出板，晾干，然后放入第二种溶液中。对第二个和第三个正在运行的解决方案重复类似的步骤;将板留在溶液中，直到溶剂前沿到达板顶部，然后取出并在室温下干燥 1 分钟。
9. 将板置于硫酸铜溶液中 7 秒。取出板，彻底干燥，然后在 170 °C 的烤箱中烘烤 7 分钟。等待板冷却。
10. 使用薄层色谱和凝胶分析软件以及图像处理软件，进行扫描和分析以识别脂质的解析条带。

Materials