高效薄层色谱法：一种用于中性粒细胞脂质初步分离与定量的技术

摘要

来源：Brogden, G., 等。研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种从人外周血来源的中性粒细胞中初步分离和定量脂质的技术。该技术有助于在进行高效液相色谱分析之前对目标分析物进行初步评估。

方案

1. 高效薄层色谱法（HPTLC）用于半定量分析多种脂质的含量，包括胆固醇、磷脂和鞘磷脂

1. 配制以下四种展开溶液和染色溶液。
   1. 溶液1：取乙酸乙酯（26.6%）、1-丙醇（26.6%）、氯仿（26.6%）、甲醇（26.6%）和氯化钾（9.6%）混合。KCl溶液的配制方法为：将0.25 g KCl溶解于100 mL高效液相色谱级水中。
   2. 溶液2：取正己烷（73%）、乙醚（23%）和柠檬酸（2%）混合。
   3. 溶液3：100%正己烷。
   4. 染色溶液的配制：将7.5 g硫酸铜溶于90 mL蒸馏水中，再加入10 mL磷酸。
2. 将每种溶液分别加入玻璃展开槽中，液面高度约为5 mm。可在每个展开槽中放入任意类型的滤纸，以加快展开速度。
3. 将一块20 cm × 10 cm的高效薄层色谱硅胶60玻璃板在第一种展开溶液中预平衡，直至展开剂迁移至板的顶端，然后在110 °C下干燥10分钟。
   注意：这些薄层板可包裹于铝箔中保存以备后续使用，使用前在110 °C下干燥10分钟即可。
4. 将从人外周血来源的中性粒细胞中提取的脂质沉淀溶解于200 µL氯仿/甲醇（1:1）溶液中，在37 °C孵育15分钟以充分溶解。
5. 使用直尺和软铅笔在板上标记所需数量的点样位置，并至少预留一个标准品位置。分别在距起点约4 cm和6 cm处标记第一种和第二种展开剂的展开距离。
6. 点样前，每次加载新样品前需用氯仿/甲醇（1:1）溶液清洗10 µL进样器3次。每份样品取10 µL逐滴点样，尽量将样品集中于最小面积内。每个样品至少需重复点样两次。
7. 将薄层板垂直放入含有第一种展开溶液（步骤1.1.1）的展开槽中。确保薄层板与玻璃槽壁保持平行，以获得均匀的迁移速度。
8. 当溶剂前沿到达第一个标记线时，取出薄层板并干燥，然后将其放入第二种展开溶液中。对第二和第三种展开溶液重复类似操作；每次展开均需让溶剂前沿迁移至板的顶端，之后取出薄层板，在室温下干燥1分钟。
9. 将薄层板浸入硫酸铜溶液中7秒，取出后彻底干燥，并在170 °C烘箱中烘烤7分钟。待薄层板冷却后再进行后续操作。
10. 使用薄层色谱与凝胶分析软件以及图像处理软件对薄层板进行扫描和分析，以鉴定分离出的脂质条带。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-丙醇	Sigma-Aldrich	33538
10 µL 注射器	Hamilton	701 NR 10 µl
乙醚	Sigma-Aldrich	346136
乙酸乙酯	Carl Roth	7336.2
五水合硫酸铜(II)	Merck	1027805000
氯仿	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS 软件	Lazarsoftware	2
甲醇	Carl Roth	7342.1
正己烷	Carl Roth	7339.1
磷酸	Sigma-Aldrich	30417
氯化钾	Merck	49,361,000
HPTLC 硅胶 60	Merck	105553