来源：LaRiviere, W. B. 等，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测糖胺聚糖。J. Vis. Exp. (2021)
本视频展示了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离从小鼠肺组织中提取的硫酸乙酰肝素的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于检测从小鼠肺组织中分离的不同链长硫酸乙酰肝素的分析技术
3.5K 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 分离纯化糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 提前配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所需的各种溶液（表1）。
注意：根据样品中预期的糖胺聚糖大小选择分离胶溶液的丙烯酰胺百分比。对于较大的片段（长度大于30个二糖亚基），建议使用15%的丙烯酰胺浓度；对于较小的片段（长度<20个二糖亚基），建议使用22%的丙烯酰胺浓度。 - 将空胶板放入PAGE电泳槽中。按以下步骤制备分离胶：取15 mL离心管，加入10 mL分离胶溶液、60 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和10 μL TEMED（最后加入TEMED）。轻轻倒置混匀2–3次。使用移液器迅速将上述10 mL溶液加入胶板中，然后在胶面上覆盖2 mL去离子过滤水，静置30分钟使分离胶充分聚合。
注意：以下PAGE操作流程已针对使用13.3 × 8.7 cm（宽×长）、厚度为1.0 mm、总体积约为12 mL的制胶胶板的垂直PAGE系统进行优化。其他胶板系统也可使用，但可能需要用户自行优化条件。 - 待分离胶完全聚合后，倒掉上层覆盖的水，按以下步骤制备浓缩胶：在15 mL离心管中加入3 mL浓缩胶溶液、90 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和3 μL TEMED（最后加入TEMED）。
- 轻轻倒置混匀2–3次。用移液器迅速将浓缩胶溶液加至已固化的分离胶上方，加至胶板满溢。将配套的梳子完全插入。静置30分钟，使浓缩胶充分聚合。
- 待凝胶完全聚合后，确认已从胶板底部撕去底部封条，并将胶板重新装入PAGE电泳槽组件中。
- 分别向上、下电泳槽中加入上槽缓冲液和下槽缓冲液。
- 将步骤1.11.4中干燥的样品溶解于最小必要体积的去离子过滤水中（最多不超过PAGE凝胶加样孔体积的50%）。按1:1比例与上样缓冲液混合。将样品及HS寡糖“分子量标准”（见表1）加入凝胶加样孔中。
- 以100 V预电泳5分钟，随后以200 V进行电泳：对于15%聚丙烯酰胺分离胶，电泳时间为20–25分钟；对于18%聚丙烯酰胺分离胶，为40–50分钟；对于22%聚丙烯酰胺分离胶，为90–100分钟。
注意：200 V下的电泳时间可能需要适当优化。酚红的迁移位置略快于含有2个聚合亚基（即聚合度为2，dp2）的肝素寡糖；溴酚蓝的迁移位置略快于dp10–dp14的寡糖。当施加电压使酚红条带迁移至接近但尚未到达凝胶底部时，可获得最佳分离效果。请据此调整电泳时间。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
表1： 纯化糖胺聚糖聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液。所有溶液在使用前必须过滤（0.22 µm）。
| 注意： 所有溶液在使用前必须经0.22μm滤膜过滤。 | |||
| 溶液 | 配方 | 成分 | 评论 |
| 分离胶/下层室电泳缓冲液（2 L 或 4 L） | 硼酸，分子量 61.83 | 2L：12.36 g；4L：24.76 g | 目标浓度：0.1 M<... |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 过硫酸铵（固体） | ThermoFisher Scientific | BP179-25 | 电泳级 |
| Barnstead GenPure Pro 水纯化系统 | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | 任何去离子/纯化水系统均可作为替代 |
| 硼酸（固体） | ThermoFisher Scientific | A73-500 | 分子生物学级 |
| 溴酚蓝（固体） | ThermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Criterion PAGE 胶板空盒（1.0 mm 厚，12+2 孔） | Bio-Rad | 3459901 | 任何 1.0 mm 厚的 PAGE 制胶板系统均可满足要求 |
| Criterion PAGE 电泳系统（电泳槽及电源） | Bio-Rad | 1656019 | 任何类似的垂直板 PAGE 系统均可使用 |
| EDTA 二钠盐（固体） | ThermoFisher Scientific | 02-002-786 | 分子生物学级 |
| 甘氨酸（固体） | ThermoFisher Scientific | G48-500 | 电泳级 |
| 盐酸（液体） | ThermoFisher Scientific | A466-250 | |
| N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（固体） | ThermoFisher Scientific | BP171-25 | 电泳级 |
| 酚红（固体） | ThermoFisher Scientific | P74-10 | 游离酸形式 |
| 蔗糖（固体） | ThermoFisher Scientific | BP220-1 | 分子生物学级 |
| TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） | ThermoFisher Scientific | BP150-20 | 电泳级 |
| Tris 碱（固体） | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | 分子生物学级 |
| 真空滤器，一次性使用，孔径 0.22 µm，聚醚砜膜，体积 500 mL | ThermoFisher Scientific | 569-0020 | 其他体积和滤膜材料可接受 |
| 丙烯酰胺（固体） | ThermoFisher Scientific | BP170-100 | 电泳级 |
| 肝素来源的十糖（dp10） | Galen scientific | HO10 | |
| 肝素来源的六糖（dp6） | Galen scientific | HO06 | |
| 肝素来源的寡糖（dp20） | Galen scientific | HO20 |
标签
