聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于检测从小鼠肺组织中分离的不同链长硫酸乙酰肝素的分析技术

摘要

来源：LaRiviere, W. B. 等，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测糖胺聚糖。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离从小鼠肺组织中提取的硫酸乙酰肝素的方法。

方案

1. 分离纯化糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳

1. 提前配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所需的各种溶液（表1）。
   注意：根据样品中预期的糖胺聚糖大小选择分离胶溶液的丙烯酰胺百分比。对于较大的片段（长度大于30个二糖亚基），建议使用15%的丙烯酰胺浓度；对于较小的片段（长度<20个二糖亚基），建议使用22%的丙烯酰胺浓度。
2. 将空胶板放入PAGE电泳槽中。按以下步骤制备分离胶：取15 mL离心管，加入10 mL分离胶溶液、60 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和10 μL TEMED（最后加入TEMED）。轻轻倒置混匀2–3次。使用移液器迅速将上述10 mL溶液加入胶板中，然后在胶面上覆盖2 mL去离子过滤水，静置30分钟使分离胶充分聚合。
   注意：以下PAGE操作流程已针对使用13.3 × 8.7 cm（宽×长）、厚度为1.0 mm、总体积约为12 mL的制胶胶板的垂直PAGE系统进行优化。其他胶板系统也可使用，但可能需要用户自行优化条件。
3. 待分离胶完全聚合后，倒掉上层覆盖的水，按以下步骤制备浓缩胶：在15 mL离心管中加入3 mL浓缩胶溶液、90 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和3 μL TEMED（最后加入TEMED）。
4. 轻轻倒置混匀2–3次。用移液器迅速将浓缩胶溶液加至已固化的分离....

结果

表1： 纯化糖胺聚糖聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液。所有溶液在使用前必须过滤（0.22 µm）。

注意： 所有溶液在使用前必须经0.22μm滤膜过滤。
溶液	配方	成分	评论
分离胶/下层室电泳缓冲液（2 L 或 4 L）	硼酸，分子量 61.83	2L：12.36 g；4L：24.76 g	目标浓度：0.1 M<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
过硫酸铵（固体）	ThermoFisher Scientific	BP179-25	电泳级
Barnstead GenPure Pro 水纯化系统	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	任何去离子/纯化水系统均可作为替代
硼酸（固体）	ThermoFisher Scientific	A73-500	分子生物学级
溴酚蓝（固体）	ThermoFisher Scientific	B392-5
Criterion PAGE 胶板空盒（1.0 mm 厚，12+2 孔）	Bio-Rad	3459901	任何 1.0 mm 厚的 PAGE 制胶板系统均可满足要求
Criterion PAGE 电泳系统（电泳槽及电源）	Bio-Rad	1656019	任何类似的垂直板 PAGE 系统均可使用
EDTA 二钠盐（固体）	ThermoFisher Scientific	02-002-786	分子生物学级
甘氨酸（固体）	ThermoFisher Scientific	G48-500	电泳级
盐酸（液体）	ThermoFisher Scientific	A466-250
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（固体）	ThermoFisher Scientific	BP171-25	电泳级
酚红（固体）	ThermoFisher Scientific	P74-10	游离酸形式
蔗糖（固体）	ThermoFisher Scientific	BP220-1	分子生物学级
TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）	ThermoFisher Scientific	BP150-20	电泳级
Tris 碱（固体）	ThermoFisher Scientific	BP152-500	分子生物学级
真空滤器，一次性使用，孔径 0.22 µm，聚醚砜膜，体积 500 mL	ThermoFisher Scientific	569-0020	其他体积和滤膜材料可接受
丙烯酰胺（固体）	ThermoFisher Scientific	BP170-100	电泳级
肝素来源的十糖（dp10）	Galen scientific	HO10
肝素来源的六糖（dp6）	Galen scientific	HO06
肝素来源的寡糖（dp20）	Galen scientific	HO20