基于分子量分离与可视化蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：用于蛋白质分析

摘要

来源：Sultana, S. 等. 处理后蛋白质聚集体的提取与可视化 大肠杆菌 使用蛋白毒性应激剂. 视觉实验杂志. (2021).

本视频展示了一种基于变性聚丙烯酰胺的蛋白质分离技术。该技术可根据蛋白质的分子量对其进行初步鉴定。

方案

1. 使用SDS-PAGE分离和可视化提取的蛋白质聚集体

1. 制备12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶
   1. 配制两块分离胶时，将5.1 mL双蒸水（ddH₂O）、3.75 mL Tris-HCl（pH 8.8）、7.5 mL 20%（w/v）SDS、6 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、75 mL 10%（w/v）过硫酸铵和10 mL四甲基乙二胺（TEMED）加入15 mL离心管中，轻轻混匀，避免产生气泡。使用1 mL移液器将混合液注入玻璃板之间，顶部预留约2 cm空间。在分离胶上层覆盖70%乙醇，以形成平整的液-胶界面。
   2. 待分离胶聚合完成后，配制浓缩胶：将1.535 mL双蒸水（ddH₂O）、625 mL Tris-HCl（pH 6.8）、12.5 mL 20%（w/v）SDS、335 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、12.5 mL 10%（w/v）过硫酸铵和2.5 mL TEMED加入离心管中混匀。吸除分离胶上方的乙醇，立即加入浓缩胶溶液，并插入所需齿数的梳子，避免产生气泡。室温下静置聚合20–30分钟。
2. 将每个样品及蛋白ladder各取4 µL分别加入不同加样孔中，在Tris-甘氨酸电泳缓冲液（表1）中以144 V电压于室温下电泳45分钟。
   注意：当溴酚蓝条带即将迁移出凝胶时，停止电泳。
3. 将凝胶置于预热的Fairbanks溶液A（表1）中，在摇床上染色30分钟。
4. 将凝胶转移至预热的Fairbanks溶液D（表1）中，在摇床上脱色至背景清晰（例如过夜）。

结果

溶液	配方
缓冲液A	10 mM 磷酸钾（pH 6.5），1 mM EDTA
缓冲液 B	含2% Nonidet P-40 的缓冲液A。可于室温保存，供后续使用。
费尔班克斯A（染色液）	25% 异丙醇，10% 冰醋酸，1.4 g 考马斯亮蓝 R-250
费尔班克斯 D（脱色液）	10% 冰醋酸溶液
裂解缓冲液	10 mM 磷酸钾（pH 6.5），1 mM EDTA，20% 蔗糖可配制后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
丙酮	Fisher Scientific	67-64-1
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）	Bio-Rad	1610156
过硫酸铵	Millipore Sigma	A3678-100G
Bluestain 2 蛋白分子量标准（5–245 kDa）	GoldBio	P008-500
β-巯基乙醇	Millipore Sigma	M6250-100ML
溴酚蓝	GoldBio	B-092-25
考马斯亮蓝 R-250	MP Biomedicals LLC	821616
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	SLBT9686
冰醋酸	Millipore Sigma	ARK2183-1L
甘油（99%）	Sigma-Aldrich	G5516-1L
甘氨酸	GoldBio	G-630-1
异丙醇（2-丙醇）	Sigma	402893-2.5L
10× MOPS 缓冲液	Teknova	M2101
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771-500G
四甲基乙二胺（TEMED）	Millipore Sigma	T9281-50ML
Tris 碱	GoldBio	T-400-1
材料/仪器
电源	ThermoFisher Scientific	EC105
摇床	Alkali Scientific	RS7235
小型玻璃板	Bio-Rad	1653311
间隔板（1 mm）	Bio-Rad	1653308
分光光度计	Thermoscientific	3339053
适用于 15 mL 离心管的台式离心机	Beckman-Coulter
垂直凝胶电泳槽	Bio-Rad	1658004
涡旋振荡器	Fisher Vortex Genie 2	12-812
恒温混匀仪	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 孔梳	Bio-Rad	1653359