用于RNA分析的变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种分离荧光标记的磷酸化RNA寡核苷酸与其非磷酸化对应物的技术

摘要

来源：Pillon, M. C.，等，测量小核苷酸底物多核苷酸磷酸化的非放射性检测方法。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们展示了一种变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，用于分离磷酸化的RNA分子与其非磷酸化形式。RNA分子经荧光标记，以便在凝胶上通过激光检测。

方案

1. 凝胶电泳

1. 制备15%丙烯酰胺/8 M尿素凝胶溶液。
   警告： 丙烯酰胺必须小心操作，因其具有神经毒性。操作时应始终佩戴手套、实验服和护目镜。
   1. 在150 mL玻璃烧杯中，加入22.5 mL预混的40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、6 mL 10×TBE缓冲液、28.8 g尿素，并用RNase-free水定容至总体积59 mL。轻轻搅拌溶液。
      注意： 根据RNA底物的长度，调整聚丙烯酰胺的百分比可能改善未磷酸化与磷酸化RNA之间的分辨效果。
   2. 为溶解尿素，将溶液放入微波炉中加热20秒，搅拌液体后立即将溶液再次放入微波炉中加热20秒。轻轻搅拌溶液，直至尿素完全溶解。
   3. 将玻璃烧杯放入盛有冷水的浅水浴中，缓慢冷却溶液。确保烧杯周围的冷水液面高于烧杯内溶液的液面，以促进高效的热传递。静置 5 min。
      注意： 如果玻璃烧杯感觉温热，请勿继续本方案；水温应低于25 °C。若5分钟后仍感觉温热，则将水浴中的水更换为新鲜的冷水，并再等待5分钟。
   4. 使用0.22 μm一次性过滤装置过滤并脱气溶液，以去除颗粒物和微小气泡。
2. 倒入变性胶
   1. 使用肥皂和温水清洗专用于凝胶的短玻璃板和长玻璃板，其整体尺寸为 31.0 cm x 38.5 cm。用 95% 乙醇喷洒每块玻璃板，并擦拭以去除任何残留的水分。
      注意： 其中一块玻璃板可进行硅化处理，以防止在分离玻璃板夹心结构时损伤凝胶。然而，此步骤并非必需，因为本实验方案的设计无需分离玻璃板即可实现RNA的可视化。
   2. 将长玻璃板水平放置在盒子上方，使其高于实验台面。
      警告： 丙烯酰胺具有毒性，因此灌胶操作台必须铺上吸水纸，以吸收任何可能溢出的液体，并在操作结束后立即将吸水纸放入废物袋中。
   3. 将一个洁净的0.4 mm垫片沿长玻片的长边放置。
   4. 将短玻璃板置于长玻璃板之上，确保短板、长板及垫片的边缘对齐。每侧使用三个等距分布的金属夹具夹紧。
   5. 向第3.1步制备的15%丙烯酰胺/8 M尿素溶液中加入24 μL TEMED，混匀溶液。
   6. 向1.2.5步骤中的溶液加入600 μL 10% (w/v) APS，轻轻混匀。
   7. 立即将溶液倒入玻璃板之间。
      注意： 为避免产生气泡，倾倒溶液时轻敲玻璃器皿。
   8. 小心地将一个干净的0.4 mm、32孔梳子插入玻璃板夹心结构的顶部。
   9. 让丙烯酰胺聚合至少30分钟。
3. 运行变性凝胶
   1. 将加热块温度设为 75 °C。
   2. 取下固定玻璃板夹层的金属夹，彻底清洗并干燥玻璃板夹层。
   3. 将玻璃板夹心结构放入凝胶装置中，短板朝内。
   4. 通过将100 mL 10x TBE与1.9 L无RNase水混合，制备0.5x TBE电泳缓冲液。将600 mL电泳缓冲液加入凝胶装置的上、下电泳槽中。
   5. 轻轻取出梳子，并使用注射器彻底冲洗加样孔。注意：此步骤对于去除加样孔中的尿素至关重要。
   6. 预先以50 W功率运行凝胶30分钟，电压约为2,000 V。注意：该凝胶装置在高功率下运行，使用者应谨慎操作。
   7. 使用注射器彻底冲洗各孔。
      注意： 此步骤对于将样品均匀加入加样孔至关重要。
   8. 瞬时离心淬灭反应液，然后在75 °C孵育3分钟，再次进行瞬时离心。
   9. 立即每孔上样10 μL，于50 W功率下电泳3 h。
      注意： 荧光标记的RNA对光敏感；因此，需用铝箔覆盖凝胶装置。
4. 成像变性凝胶。
   1. 关闭电源，排空凝胶装置上层室中的缓冲液。
   2. 用肥皂和水清洗并擦干玻璃板夹的外侧。在运输凝胶时，用铝箔覆盖玻璃板夹。
   3. 将玻璃板夹心结构安装到具备定量和高灵敏度荧光检测能力的激光扫描仪载物台上。
      注意： 该凝胶极薄，以实现最高分辨率。因此，本实验方案设计为通过直接透过玻璃板观察荧光标记的RNA，从而避免将凝胶从玻璃板夹心中剥离所带来的困难。使用市售的低荧光玻璃板可提高信噪比，增强检测信号。
   4. 为所需的荧光染料设置激光扫描仪的激发和发射波长。
      注意： 特定荧光染料的最佳激发和发射波长可能有所不同。对于FAM荧光染料，其激发波长和发射波长分别为495 nm和535 nm。
   5. 在激光扫描仪载物台上定义待成像区域，并根据制造商说明书对凝胶进行成像 （图1）。

结果

图1： 磷酸化RNA的变性凝胶分析示例。 Las1-Grc3（110 nM）与500 nM SC-ITS2 RNA孵育的体外RNA激酶反应。X标记未添加Las1-Grc3的对照反应，黑色三角形表示ATP从0至10 mM的梯度滴定。C2 RNA是Las1核酸酶对SC-ITS2 RNA切割后的产物，也是Grc3 PNK活性的内源性底物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4 mm 34孔梳	BioRad	1653848
0.4 mm 间隔器	BioRad	1653812
0.5 M EDTA pH 8.0	KD Medical	RGF-3130
1M 氯化镁	KD Medical	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medical	RGF-3360
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1	BioRad	1610146
5M 氯化钠	KD Medical	RGF-3720
过硫酸铵（APS）	BioRad	161-0700
ATP	Sigma	A2383-1G
硼酸	Sigma	B0394
溴酚蓝钠盐	Sigma	B5525-5G
玻璃板	Thomas Scientific	1188K51
Hoefer SQ3 测序仪	Hoefer	N/A
Image J 软件	N/A	N/A	<a href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a>
标记的RNA寡核苷酸	IDT	定制订单
Pharmacia EPS 3500 电源	Pharmacia	N/A
Steriflip 0.22 µm 滤器	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
Tris 碱	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 凝胶成像系统	GE Healthcare	N/A
超纯DEPC水	Invitrogen	750023
超纯甘油	Invitrogen	19E1056865
尿素	Fisher Chemical	U15-500