用于RNA分析的变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种分离荧光标记的磷酸化RNA寡核苷酸与其非磷酸化对应物的技术

摘要

来源：Pillon, M. C.，等，测量小核苷酸底物多核苷酸磷酸化的非放射性检测方法。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们展示了一种变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，用于分离磷酸化的RNA分子与其非磷酸化形式。RNA分子经荧光标记，以便在凝胶上通过激光检测。

方案

1. 凝胶电泳

1. 制备15%丙烯酰胺/8 M尿素凝胶溶液。
   警告： 丙烯酰胺必须小心操作，因其具有神经毒性。操作时应始终佩戴手套、实验服和护目镜。
   1. 在150 mL玻璃烧杯中，加入22.5 mL预混的40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、6 mL 10×TBE缓冲液、28.8 g尿素，并用RNase-free水定容至总体积59 mL。轻轻搅拌溶液。
      注意： 根据RNA底物的长度，调整聚丙烯酰胺的百分比可能改善未磷酸化与磷酸化RNA之间的分辨效果。
   2. 为溶解尿素，将溶液放入微波炉中加热20秒，搅拌液体后立即将溶液再次放入微波炉中加热20秒。轻轻搅拌溶液，直至尿素完全溶解。
   3. 将玻璃烧杯放入盛有冷水的浅水浴中，缓慢冷却溶液。确保烧杯周围的冷水液面高于烧杯内溶液的液面，以促进高效的热传递。静置 5 min。
      注意： 如果玻璃烧杯感觉温热，请勿继续本方案；水温应低于25 °C。若5分钟后仍感觉温热，则将水浴中的水更换为新鲜的冷水，并再等待5分钟。
   4. 使用0.22 μm一次性过滤装置过滤并脱气溶液，以去除颗粒物和微小气泡。
2. 倒入变性胶
   1. 使用肥皂和温水清洗专用于凝胶的短玻璃板和长玻璃板....

结果

图1： 磷酸化RNA的变性凝胶分析示例。 Las1-Grc3（110 nM）与500 nM SC-ITS2 RNA孵育的体外RNA激酶反应。X标记未添加Las1-Grc3的对照反应，黑色三角形表示ATP从0至10 mM的梯度滴定。C2 RNA是Las1核酸酶对SC-ITS2 RNA切割后的产物，也是Grc3 PNK活性的内源性底物。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4 mm 34孔梳	BioRad	1653848
0.4 mm 间隔器	BioRad	1653812
0.5 M EDTA pH 8.0	KD Medical	RGF-3130
1M 氯化镁	KD Medical	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medical	RGF-3360
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1	BioRad	1610146
5M 氯化钠	KD Medical	RGF-3720
过硫酸铵（APS）	BioRad	161-0700
ATP	Sigma	A2383-1G
硼酸	Sigma	B0394
溴酚蓝钠盐	Sigma	B5525-5G
玻璃板	Thomas Scientific	1188K51
Hoefer SQ3 测序仪	Hoefer	N/A
Image J 软件	N/A	N/A	<a href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a>
标记的RNA寡核苷酸	IDT	定制订单
Pharmacia EPS 3500 电源	Pharmacia	N/A
Steriflip 0.22 µm 滤器	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
Tris 碱	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 凝胶成像系统	GE Healthcare	N/A
超纯DEPC水	Invitrogen	750023
超纯甘油	Invitrogen	19E1056865
尿素	Fisher Chemical	U15-500