二维半变性琼脂糖凝胶电泳：一种基于大小异质性分离多态性淀粉样纤维的技术

摘要

来源：Hanna-Addams, S., 等 利用二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳确认淀粉样或类淀粉样纤维的大小异质性. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了基于二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳的淀粉样纤维分离方法。该技术根据淀粉样聚集体的异质性大小，实现其多态性聚集体的分离。

方案

1. 准备样品

1. 在含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的10 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于10 cm组织培养皿中培养2 × 10⁶个产生淀粉样蛋白的HT-29结肠癌细胞。将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养过夜。
   1. 当细胞生长至80%融合度时，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入3 mL胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育3分钟。
   2. 待细胞完全从培养皿上解离后，加入10 mL培养基，用10 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中。在室温下以1,000 × g离心3分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 mL培养基中，并使用细胞计数器计数细胞。将2 × 10⁶个细胞接种至两个10 cm培养皿中，每皿各一。
   3. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中贴壁并恢复过夜。对其中一个培养皿施加处理，以诱导淀粉样蛋白形成：加入20 ng/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、100 nM Smac模拟物和20 µM泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK。该组合简称为TSZ。另一培养皿则以溶剂处理作为对照。
2. 经过适当时间（通常为6小时）后，收集细胞裂解液。
   1. 用塑料刮刀将细胞从培养皿上刮下，并用10 mL移液器转移至15 mL锥形管中。在4 °C下以....

结果

图1. 实验方案。（A）二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（2D SDD-AGE）示意图。从最右侧标为红色的加样孔开始加样。第一维电泳结束后，将凝胶逆时针旋转90°，然后进行第二维电泳。实线箭头表示第一维电泳方向，虚线箭头表示第二维电泳方向。（B）毛细作用转移示意图

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
凝胶电泳装置	Fisher	HE99XPRO	凝胶电泳装置
琼脂糖	VWR	97062-250	用于琼脂糖凝胶。
DMEM	Sigma	D6429	用于细胞培养
胎牛血清	Sigma	F4135	用于细胞培养
青霉素-链霉素	Sigma	P4333	用于细胞培养
胰蛋白酶溶液	Sigma	T4049	用于细胞培养
组织培养用 PBS	Sigma	D8662	用于细胞培养
重组 TNF	本实验室制备		用于诱导坏死性凋亡。
Smac-模拟物	王孝东博士惠赠		用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献11。
Z-VAD-FMK	ApexBio	A1902	用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献11。
细胞计数仪	Bio-Rad	1450102	Model TC20；用于细胞计数
Pierce™ BCA 蛋白测定试剂盒	Thermo Scientific	23225	用于测定细胞裂解液中的蛋白质浓度
细胞刮刀	Fisher	07-200-364	从培养皿中收集细胞
裂解缓冲液（1 L）			20 mL 1 M Tris（pH 7.4）<br/> 10 mL 甘油<br/> 30 mL 5 M NaCl<br/> 840 mL ddH₂O<sub>2</sub>O<br/> 10 mL Triton-X100<br/> （根据需要添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂）
10倍浓度TAE缓冲液（1 L）			48.4 g Tris 碱<br/> 11.42 mL 冰醋酸<br/> 20 mL 0.5 M EDTA，pH 8<br/> ddH2O 至 1 L
4X SDD-AGE上样缓冲液（50 mL）			5 mL 10X TAE<br/> 10 mL 甘油<br/> 4 mL 20% SDS<br/> 0.5 mL 10% 溴酚蓝<br/> 31 mL ddH₂O<sub>2</sub>O
PBST 洗涤缓冲液（1 L）			100 mL 10×PBS<br/> 800 mL ddH₂O<sub>2</sub>O<br/> 1 mL 吐温20
10倍浓度 PBS（10 L）			800 g 氯化钠<br/> 20 g KCl<br/> 144 g 钠<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>&middot;2H<sub>2</sub>O<br/> 24 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub><br/> 加入ddH₂O<sub>2</sub>0 至 10 升