来源：Rhinesmith, T. 等，Multimer-PAGE：一种用于捕获和分离生物样品中蛋白质复合物的方法。J. Vis. Exp. (2017)。
本视频介绍了用于从组织匀浆中分离天然蛋白质复合物的多聚体PAGE技术。该技术是蓝色天然PAGE与SDS-PAGE技术的结合。分离得到的复合物可用于表征并研究其在细胞功能中的作用。
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用于分离天然蛋白质复合物的多聚体PAGE：一种结合蓝非变性PAGE与SDS-PAGE的混合分离技术，用于从组织裂解液中分离完整的多聚体蛋白质
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 组织制备
- 配制 10 mL 的 4x BN-PAGE 样品缓冲液（200 mM 双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷（Bis-Tris）、200 mM NaCl、40% w/v 甘油、0.004% 丽春红 S、pH 7.2）。
注意：该储备液可预先配制，并在 4 °C 下保存。 - 将 250 μL 的 4x 样品缓冲液加入含 1x 商用蛋白酶抑制剂混合液的 750 μL dH2O 中稀释。涡旋混匀后置于冰上冷却。
- 用预冷的 Dounce 匀浆器在 1 mL 1x 冰冷 BN-PAGE 样品缓冲液中对 20 mg 目标组织进行匀浆，上下抽打 30 次。
注意：本演示实验中，目标组织为大鼠全脑组织。匀浆后，样品可用温和去垢剂（如 2% 洋地黄皂苷）处理，以溶解膜蛋白并使其适用于电泳分析。 - 将匀浆液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 14,000 x g 条件下离心 30 分钟，以沉淀不溶性细胞成分。离心后，将上清液小心倾入置于冰上的洁净离心管中。
- 按照制造商说明，使用二喹啉甲酸（BCA）或其他类似的蛋白质定量检测方法测定上清液中的蛋白质浓度。
- 若匀浆样品中含有去垢剂，加入适量的 5% 水溶性考马斯亮蓝 G-250 溶液，使匀浆液中最终考马斯亮蓝浓度达到 0.25%。
2. BN-PAGE
- 将25 mL 20倍蓝-native（BN）电泳缓冲液原液（1.0 M Bis-Tris，1.0 M 三羟甲基氨基甲烷，pH 6.8）加入475 mL含0.002% 考马斯亮蓝的去离子水（dH2O）中，配制成500 mL的1倍运行缓冲液。
- 如果样品含有去垢剂，则改为配制250 mL含0.02% 考马斯亮蓝的1倍运行缓冲液，另配250 mL不含考马斯亮蓝的1倍运行缓冲液。
- 将缓冲液冷却至4 °C。
- 根据制造商说明，清洗并组装聚丙烯酰胺凝胶灌注夹具。
- 按照标准配方灌注BN聚丙烯酰胺凝胶（3% T浓缩层，6% T分离层），并插入加样梳。
- 待凝胶聚合完成后，用去离子水（dH2O）冲洗夹具，并根据制造商说明组装电泳装置。
- 移除加样梳，并用1倍BN-PAGE运行缓冲液填充加样孔。在加样完成前，避免将内槽完全注满缓冲液。
- 如果样品含有去垢剂，则使用含0.02% 考马斯亮蓝的缓冲液填充加样孔。
注意：步骤 2.7–2.9 应在4 °C下进行。
- 如果样品含有去垢剂，则使用含0.02% 考马斯亮蓝的缓冲液填充加样孔。
- 使用凝胶加样枪头，向目标加样孔中加入含有20 μg蛋白质的匀浆液。向未使用的加样孔中加入等体积的1倍BN-PAGE上样缓冲液。
注意：根据BCA测定结果确定的蛋白浓度，计算需加入加样孔的匀浆液体积。 - 加样完成后，向内槽加入1倍BN-PAGE运行缓冲液，确保凝胶完全浸没于缓冲液中。随后，向外部槽中加入1倍运行缓冲液至制造商指定液面高度。
- 如果样品含有去垢剂，则内槽使用含0.02% 考马斯亮蓝的1倍缓冲液，外槽使用无染料的1倍运行缓冲液。
- 将电极连接至电源，以150 V电压进行电泳，直至染料条带进入分离层约2 cm处。停止电泳并断开电源。
3. 交联
注意：在 4 °C 下执行步骤 3.1-3.6。
- 拆卸电泳装置，分离凝胶盒的玻璃板。移除并弃去浓缩胶层。
- 在染料前沿底部边缘稍下方小心切割凝胶，尽量使切口平滑且笔直，然后弃去未使用的凝胶部分。这样将留下一条约 2 cm 宽的水平聚丙烯酰胺凝胶条，其中包含匀浆样品中的全部蛋白质。
- 修剪掉凝胶条边缘未使用的部分。
- 小心地将凝胶条放入盛有 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的小容器中，通过温和振荡孵育 30 分钟以达到平衡。
- 平衡后，倒掉 PBS 并更换为另 10 mL 新鲜 PBS。加入 500 μL 溶于二甲基亚砜中的 25 mM DSP，继续按前述方式（步骤 3.4）振荡混合 30 分钟。
- 倒掉 DSP 溶液，加入 10 mL 含 2% 十二烷基硫酸钠（SDS）的 0.375 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 8.8，以淬灭未反应的 DSP。继续振荡 15 分钟。
4. SDS-PAGE
- 在凝胶条淬灭的同时，根据标准方法配制SDS-PAGE凝胶溶液。不要加入聚合试剂。
- 淬灭后，将ΒΝ凝胶条恢复至室温，并将其装入新的凝胶板中。
- 小心地取出凝胶，将其放置在干净的凝胶盒间隔板上。
- 将条带方向调整至染料前沿的底部最靠近新暗盒的顶部即，在BN-PAGE中迁移距离最远的一侧应靠近新胶盒的顶部；需将胶条相对于其先前方向翻转）。参见 图1.
- 将条带放置在其上边缘与盖板上边缘将要对齐的位置即，它将位于新凝胶的顶部）。确保染料前沿与玻璃板的水平边缘平行。
- 将切除的条带一侧紧贴间隔片的一侧壁，另一侧留出空间用于倒入凝胶以及加样蛋白标准品或蛋白ladder。
- 如果凝胶条的底边存在任何参差不齐或不平整的区域，应小心将其切除。若不切除，这些区域在灌胶过程中会截留气泡。
- 当胶条位置正确后，将盖板置于间隔板上，轻轻按压以排出任何滞留的气泡。
- 根据制造商说明继续组装凝胶灌注装置。
- 将聚合试剂加入分离胶缓冲液中，用血清移液管将其注入已准备好的胶板中。灌胶至比切除的BN-PAGE胶条低约2 cm处，以预留浓缩胶层的空间。
- 在灌注的凝胶上层加入100 μL正丁醇，静置30分钟以使分离胶充分聚合。随后倾去正丁醇。
- 向浓缩胶溶液中加入聚合试剂。使用刻度移液管将浓缩胶层倒入凝胶板中，直至填满凝胶夹层内的所有剩余空间。
- 倾倒浓缩胶时倾斜胶板，使其充满胶条下方的空间，避免产生气泡。
- 当浓缩胶缓冲液填充凝胶条下方的空隙时，逐渐将凝胶夹板恢复至水平位置。
- 继续用浓缩胶缓冲液填充切下的胶条旁边的空隙，直至接近溢出。
- 让浓缩胶室温静置聚合30分钟。
注意： 在凝胶聚合的同时配制10×SDS-PAGE电泳缓冲液（250 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、1.9 M 甘氨酸、1% SDS）。该缓冲液也可提前配制，并于室温保存。 - 将 50 mL 10x SDS-PAGE 电泳缓冲液原液加入 450 mL dH₂O 中稀释2O 以配制 1x 工作缓冲液。
- 凝胶浓缩层聚合后，将凝胶板从灌胶装置中取出，用去离子水冲洗2O，并根据制造商说明组装电泳装置。
- 用1× SDS-PAGE电泳运行缓冲液完全充满内槽，然后将外槽加液至制造商指定的液面高度。
- 在切除的胶条旁边加样孔中加入分子量标记物或适当的蛋白质标准品。
- 将电极连接至电源，以120 V电压进行电泳。当考马斯亮蓝染料跑出凝胶时，停止电泳并断开电源。
- 使用电转印和抗体结合检测蛋白质的标准方法分析凝胶。
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结果
图1：多聚体-PAGE通用流程图。
（A）使用非变性方法制备组织裂解液，例如在BN-PAGE样品缓冲液中进行匀浆。（B）将裂解液上样至BN-PAGE凝胶中，然后在BN-PAGE电泳缓冲液中进行电泳（150伏），使样品迁移至染料前沿进入分离胶约2 cm处。（C）切去浓缩胶层及分离胶中未使用的部分。（D）将凝胶条浸入PBS中，振荡平衡30分钟。（E）移除PBS，再将凝胶条浸入含2.5 mM DSP的PBS中，振荡30分钟。（
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <strong>化学品</strong> | |||
| ε-氨基己酸 | Sigma | A2504 | |
| 丙烯酰胺 | Acros Organics | 164855000 | 有毒。 |
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1（40%T 储存液） | BioRad | 161-0148 | 有毒。 |
| 过硫酸铵 | Sigma | A3678 | |
| 山羊抗兔 IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| 双辛可宁酸检测试剂盒 | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9647 | |
| 丁醇 | Fisher Scientific | A399-1 | |
| 化学发光底物试剂盒 | ThermoFisher | 24078 | |
| 考马斯亮蓝 G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| 皂苷 | Sigma | D141 | 有毒。 |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯） | Thermo Scientific | 22585 | |
| 脱脂奶粉 | LabScientific | M0841 | |
| 甘油 | Sigma | G9012 | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermofisher | 78430 | |
| 盐酸 | Fisher Scientific | A144SI-212 | 用于滴定。腐蚀性。 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412-4 | 用于 PVDF 膜活化。有毒。 |
| 兔源单克隆抗 α-突触核蛋白 IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 | Sigma | T9281 | |
| N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 | Acros Organics | 16479 | 有毒。 |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| 聚山梨酯 20（Tween-20） | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 聚偏氟乙烯转印膜 | Thermo Scientific | 88518 | |
| 丽春红 S | Sigma | P3504 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | P217-3 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | P9791 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS 溶液（10% w/v） | BioRad | 161-0416 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma | L37771 | |
| 磷酸二氢钠 | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl（0.5 M 缓冲液，pH 6.8） | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl（1.5 M 缓冲液，pH 8.8） | BioRad | 161-0798 | |
| <strong>仪器</strong> | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ 软件 NIH | |||
| Synergy H1 微孔板读板仪 | BioTek | ||
| Gel Former + 支架 | Biorad | ||
| Microfuge 22R 离心机 | Beckman Coulter | ||
| 2 mL Dounce 匀浆器 | |||
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | ||
| 超声组织匀浆器 | Fisher Scientific | FB120220 |
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