用于分离天然蛋白质复合物的多聚体-PAGE:一种由蓝色非变性 PAGE 和 SDS-PAGE 组成的杂化分离技术，用于从组织裂解物中分离完整的多聚体蛋白质

Abstract

来源:Rhinesmith， T. et al.， Multimer-PAGE:一种在生物样品中捕获和解析蛋白质复合物的方法。J. Vis. Exp.（2017 年）。

该视频介绍了用于从组织匀浆中分离天然蛋白质复合物的多聚体 PAGE。该技术是蓝色天然 PAGE 和 SDS-PAGE 技术的混合体。可以表征和研究分离的复合物在细胞功能中的作用。

Protocol

1. 组织制备

1. 准备 10 mL 的 4x BN-PAGE 样品缓冲液（200 mM 双（2-羟乙基）氨基-三（羟甲基）甲烷 （Bis-Tris），200 mM NaCl，40% w/v 甘油，0.004% 丽春红 S，pH 7.2><）。 注意:该储备溶液可以提前制备并储存在 4 °C 下。
2. 在含有 1 x 市售蛋白酶抑制剂混合物的 750 μL dH₂O 中稀释 250 μL 4x 样品缓冲液。在冰上涡旋和冷却。
用
3. 干净的 dounce 匀浆器在 1 mL 1x 冰冷的 BN-PAGE 样品缓冲液中匀浆 20 mg 目标组织 30 次。
   注意:对于该演示实验，目标组织是整个大鼠脑组织。均质化后，样品可以用温和的去污剂（如 2% 洋地黄皂苷）处理，以溶解并允许膜蛋白的电泳。
4. 将匀浆转移到 1.5 mL 微量离心管中，并以 14,000 x g 离心 30 分钟以沉淀不溶性细胞内容物。离心后，将上清液倒入冰上的干净试管中。
5. 按照制造商的说明使用二辛可宁酸 （BCA） 或类似的蛋白质定量测定法测量上清液蛋白浓度。
6. 如果匀浆样品含有去污剂，则在足以使匀浆溶液达到 0.25% 考马斯的水溶液中加入一定量的 5% 考马斯蓝 G-250。

2. BN-PAGE

1. 将 25 mL 20x 蓝色天然 （BN） 电泳缓冲液储备液（1.0 M Bis-Tris，1.0 M tricine，pH 6.8）稀释到含有 0.002% 考马斯蓝的 475 mL dH₂O 中，制成 500 mL 1x 电泳缓冲液。
   1. 如果样品含有去污剂，则制备 250 mL 含 0.02% 考马斯的 1x 电泳缓冲液，再制备 250 mL不含去污剂的 1x 电泳缓冲液。
2. 将缓冲液冷却至 4 °C。
3. 根据制造商的说明清洁和组装聚丙烯酰胺凝胶倾倒盒。
4. 根据标准配方倒入 BN 聚丙烯酰胺凝胶（3% T 堆积层，6% T 分离层），并放置孔梳。
5. 凝胶聚合后，用 dH₂O 冲洗凝胶盒，并根据制造商的说明组装电泳仪。
6. 取下孔梳，用 1x BN-PAGE 运行缓冲液填充孔。在上样之前，避免用缓冲液填充整个内腔。
   1. 如果样品含有去污剂，则用含有 0.02% 考马斯蓝的缓冲液填充孔><。 注意:在 4 °C 下执行步骤 2.7-2.9。
7. 使用凝胶加载吸头，将含有 20 μg 蛋白质的匀浆体积移液到所需的孔中。将等体积的 1x BN-PAGE 样品缓冲液移液到任何未使用的孔中。
   注意:使用从 BCA 测定中测定的蛋白质浓度来计算要添加到孔中的匀浆的适当体积。
8. 加载样品后，用 1x BN-PAGE 运行缓冲液填充内腔。确保凝胶完全浸没在缓冲液中。接下来，用 1x 电泳缓冲液填充外腔至制造商指示的水平。
   1. 如果样品含有去污剂，则用含有 0.02% 考马斯蓝的 1x 缓冲液填充内腔，用不含染料的 1x 电泳缓冲液填充外腔。
9. 将电极连接到电源，并在 150 V 下对凝胶中的蛋白质进行电泳，直到染料条带进入 ~2 cm 进入分离层。停止并断开电源。

3. 交联

注意:在 4 °C 下执行步骤 3.1-3.6。

1. 拆卸电泳仪并分离凝胶盒的玻璃板。移除并丢弃堆叠层。
2. 小心地切割染料前沿底部边缘下方的凝胶。注意使这个切口尽可能光滑和笔直，然后丢弃未使用的凝胶。这将留下一条 ~2 cm 宽的水平聚丙烯酰胺凝胶条带，其中包含匀浆样品中的所有蛋白质。
3. 修剪掉凝胶条边缘任何未使用的部分。
4. 小心地将试纸条放入小容器中的 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并通过章动轻轻混合 30 分钟以达到平衡。
5. 平衡后，弃去并用另外 10 mL 替换 PBS。将 500 μL 溶解在二甲基亚砜中的 25 mM DSP 移液到 PBS 中，然后继续按上述方式混合（步骤 3.4）30 分钟。
6. 倒出 DSP 解决方案。加入 10 mL 含有 2% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 的 0.375 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐 （Tris-HCl），pH 8.8，以淬灭未反应的 DSP。继续章动 15 分钟。

4. SDS-PAGE

1. 当凝胶条淬灭时，根据标准方法制备 SDS-PAGE 凝胶溶液。请勿添加聚合试剂。
2. 淬灭后，将 ΒΝ 凝胶条放回室温，并将 ΒΝ 凝胶条浇注到新的凝胶盒中。
   1. 为此，请小心地拾取凝胶并将其放在干净的凝胶盒间隔板上。
   2. 调整胶条的方向，使染料前部的底部最靠近新凝胶盒的顶部（即，在 BN-PAGE 过程中移动最远的一侧应最靠近新凝胶盒的顶部;凝胶条应从其先前的方向翻转）。参见图 1。
   3. 放置条带，使其顶部边缘与盖板的顶部边缘所在位置齐平（即，它将位于新凝胶的顶部）。确保染料正面与玻璃板的水平边缘平行。
   4. 将切除的试纸条的一侧推向其中一个间隔壁，在另一侧留出空间，以便注入凝胶和加载蛋白质标准品或分子量标准品。
   5. 如果凝胶条的底部边缘包含任何锯齿状或不均匀的区域，请小心地将其切掉。如果存在，它们会在凝胶倾注过程中捕获气泡。
   6. 凝胶条正确定位后，将盖板放在垫片板上。轻轻按压以推出任何滞留的气泡。
   7. 根据制造商的说明继续组装凝胶倾倒装置。
3. 将聚合试剂添加到分离凝胶缓冲液中，并使用血清移液管将其倒入准备好的凝胶盒中。将凝胶盒填充至切除的 BN-PAGE 凝胶条下方 ~2 cm，为堆积层留出空间。
4. 在倒入的凝胶顶部加入 100 μL 丁醇，并等待 30 分钟使分离层聚合。倒出丁醇。
5. 向浓缩胶溶液中加入聚合试剂。使用血清移液管，倒入堆积层以填充凝胶盒中所有剩余的空白空间。
   倒入
   1. 浓缩层时倾斜凝胶盒，使其充满凝胶条下方的空间，并且不会捕获气泡。
   2. 当浓缩凝胶缓冲液填充凝胶条下方的空白空间时，逐渐将凝胶盒放回水平位置。
   3. 继续用浓缩凝胶缓冲液填充切除的凝胶条旁边的空白空间，直到它几乎溢出。
6. 让堆积层聚合 30 分钟
   注意:在凝胶聚合时制备 10x SDS-PAGE 电泳缓冲液（250 mM 三（羟甲基）氨基甲烷 （tris），1.9 M 甘氨酸，1% SDS）。这也可以事先制作并在室温下储存。
7. 将 50 mL 10x SDS-PAGE 电泳缓冲液原液稀释到 450 mL dH₂O 中，制成 1x 工作缓冲液。
8. 堆积层聚合后，从浇注装置中取出凝胶盒，用 dH₂O 冲洗，然后根据制造商的说明组装电泳装置。
9. 用 1x SDS-PAGE 运行缓冲液完全填充内腔，然后将外腔填充至制造商指示的水平。
10. 用分子量标准或适当的蛋白质标准品加载切除的凝胶条旁边的空间。
11. 将电极连接到电源，并在 120 V 下对样品进行电泳。当考马斯染料从凝胶中流出时，停止并断开电源。
12. 使用电印迹和抗体结合蛋白检测的标准方法分析凝胶。

Results

图 1:通用多聚体 PAGE 流程图。
（A） 使用非变性方法制备组织裂解物，例如在 BN-PAGE 样品缓冲液中匀浆。（B） 将裂解物移液到 BN-PAGE 凝胶中，然后在 BN-PAGE 电泳缓冲液中进行电泳（150 伏）。让样品迁移，直到染料前沿迁移到分离胶中 ~2 cm。（C） 去除堆叠层和分离层的未使用部分。（D） 将凝胶条浸入 PBS 中，振荡平衡 30 分钟。（E） 去除 PBS，然后将凝胶条重新浸入含有 2.5 mM DSP 的 PBS 中。摇晃 30 分钟。（F） 去除 DSP 溶液，然后将凝胶条重新浸入含有 2% SDS 的 375 mM Tris 中并摇晃 30 分钟。凝胶条中存在的复合物现在通过交联稳定。（

Materials