毛细管电泳：一种用于分析荧光标记聚合酶链式反应扩增子的技术

摘要

来源：Gulla, S. 等，利用多重PCR和毛细管电泳对鱼类致病菌Yersinia ruckeri进行多位点可变数目串联重复序列分析。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了毛细管电泳技术，用于根据大小分析从各种样本中获得的荧光标记PCR扩增子。该技术利用每个片段中标记的荧光染料，生成迁移图谱，从而确定片段的碱基对长度。

方案

1. 毛细管电泳设置与运行条件

1. 确认PCR扩增产物后，将PCR产物用纯化水按1:10（v/v）稀释。密封、混匀并短暂离心。
2. 在通风橱内操作，为每个PCR产物配制主混合液，包含9 µL甲酰胺和0.5 µL大小标准品（额外准备10%余量）。短暂涡旋混匀，将9.5 µL分装至适用于所用毛细管电泳（CE）系统的反应板孔中，然后加入0.5 µL稀释后的PCR产物。密封、混匀并短暂离心。
   注意： 请小心操作。甲酰胺与水混合会生成有毒的甲酸。
3. 使用PCR热循环仪，将样品在95 °C变性3分钟，随后无限期冷却至4 °C。短暂离心后，根据仪器制造商的说明，将反应板装载到已校准的CE系统中。
4. 根据所选设备及以下参数，使用相应的试剂进行片段分析毛细管电泳（CE）：60 °C；1.6 kV（32 V/cm）条件下进样5秒；15 kV（300 V/cm）条件下运行32分钟。在24根毛细管（50 cm）系统上对24个孔进行CE片段分析通常约需50分钟。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Avant 3500xL 遗传分析仪	Thermo Fisher Scientific	A30469	用于毛细管电泳片段分析。
GelRed 核酸染料，水溶液，10,000X	Biotium	41003	在凝胶电泳过程中使用的荧光核酸染料。
GeneMapper 软件 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	用于读取毛细管电泳产生的电泳图谱。
GeneScan 600 LIZ 染料尺寸标准品 v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	毛细管电泳过程中使用的尺寸标准品。
Hi-Di 去离子甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	毛细管电泳过程中使用的去离子甲酰胺。需制备工作分装液。
Milli-Q 水	NA	NA	PCR 和毛细管电泳过程中使用的纯化水。标准配方，由实验室自制。
POP-7 聚合物，适用于 3500 Dx/3500xL Dx 遗传分析仪	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	毛细管电泳过程中使用的分离基质。
基于紫外光的凝胶成像/可视化系统	根据需要选择。	NA
涡旋振荡器	根据需要选择。	NA