碱性单细胞凝胶电泳：一种用于化疗后单个癌细胞DNA损伤定量检测的高灵敏度技术

摘要

来源：Lu, Y., 等 评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤 视频实验杂志 (2017)

在本视频中，我们演示了一种碱性单细胞凝胶电泳实验方法，用于定量检测经阿霉素处理的细胞中单链和双链DNA断裂。在碱性条件下，DNA碱基对之间的氢键被破坏，导致DNA双链完全解旋和分离。在电泳过程中，未损伤和已损伤的DNA片段在琼脂糖凝胶中发生差异迁移，形成彗星状结构：迁移较慢的未损伤DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的损伤DNA片段则形成拉长的彗星尾部。

方案

1. 准备试剂

1. 1x PBS
   1. 将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释，并使用 pH 计调节 pH 至 7.4。室温保存。
2. 裂解液 (LS)
   1. 在 900 mL dH₂O 中配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计调节 pH 至 10。加入 1% 月桂酰基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，并定容至 1,000 mL。使用前于 4°C 冷却至少 30 分钟。
3. 碱性电泳液 (AES)，pH >13
   1. 在 800 mL dH₂O 中配制 200 mM NaOH 和 1 mM 二钠 EDTA。调节 pH 并确保其 pH >13。定容至 1,000 mL。使用前新鲜配制，并于 4°C 冷却至少 30 分钟。
4. 染色液
   1. 将 1 μL 10,000 倍绿色荧光核酸染料 (例如，SYBR....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS（无 Ca++、Mg++）	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma 碱	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
月桂酰肌氨酸钠	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
SYBR Green	Invitrogen	S33102
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520
琼脂糖	Invitrogen	16500
95% 乙醇	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
胰蛋白酶	GIBCO	25300-054
玻璃组织切片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes 纸巾	KIMberly-Clark
1.5 mL 微量离心管	DENVILLE
移液器吸头	SHARP
微波炉	Avanti
水浴锅	PRECISION
水平电泳槽	TREVIGEN	Cometassay ES II
电源	Bio-Rad
培养箱	Quincy Lab	Model 12-140E
荧光显微镜	Zeiss	LSM700
微量移液器	Eppendorf