碱性单细胞凝胶电泳:一种用于定量估计化疗后单个癌细胞中 DNA 损伤的灵敏技术

Abstract

来源:Lu， Y.， et al. 使用彗星检测评估体外 DNA 损伤 J. Vis. Exp. （2017 年）

在本视频中，我们演示了碱性单细胞电泳测定法，用于定量阿霉素处理细胞中的单链和双链 DNA 断裂。碱性条件会破坏 DNA 碱基对之间的氢键，导致 DNA 链完全解旋和分离。这允许在电泳时琼脂糖凝胶中未受损和受损的 DNA 片段进行差异迁移，揭示形成圆形彗星头的缓慢迁移未受损 DNA 的彗星状结构，并快速迁移形成细长彗星尾部的受损 DNA 片段。

Protocol

1. 准备试剂

1. 1x PBS
   1. 用 900 mL dH₂O 稀释 100 mL 10x PBS，并使用 pH 计将 pH 调节至 7.4。在室温下储存。
2. 裂解液 （LS）
   1. 在 900 mL dH₂O 中制备 2.5 M NaCl、100 mM EDTA 二钠、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH;通常需要大约 20 分钟才能让混合物完全溶解。使用 pH 计将 pH 调节至 10。加入 1% 十二烷基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，并将最终体积调节至 1,000 mL。使用前冷却至 4°C 至少 30 分钟。
3. 碱性电泳溶液 （AES），pH >13
   1. 在 800 mL dH₂O 中制备 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠。调整 pH 并确保其 pH 值为 >13。将最终体积调整为 1,000 mL。使用前新鲜，使用前冷却至 4°C 至少 30 分钟
4. 染色液
   1. 1. 在 30 mL Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 二钠，pH 7.4）中加入 1 μL 10,000x 绿色荧光核酸染料（例如 SYBR Green），并在 4°C 下储存。
5. 1% 低熔点琼脂糖
   1. 在微波炉中熔化 1% 低熔点琼脂糖（1 g 溶于 100 mL dH₂O）。每 15-20 秒旋转一次琼脂糖，以确保琼脂糖完全熔化。使用前将琼脂糖置于 37°C 水浴中至少 20 分钟。
6. 预热移液器吸头
   将
   1. P200 移液器吸头的窄端切掉 3 mm，并在 37°C 下加热，然后再移液琼脂糖。

2. 准备 Comet 幻灯片

1. 载玻片涂层
   1. 将 1% 琼脂糖（1 g 溶于 100 mL dH₂O）在微波炉中熔化 2 - 3 分钟，或直至琼脂糖完全熔化。将玻璃显微镜载玻片浸入琼脂糖中，并使用无绒抹布擦拭载玻片的一侧。
   2. 将玻片放在平坦的表面上风干或在 50°C 下加热以加快干燥;干燥后应形成透明的琼脂糖膜。使用前将涂层载玻片置于 37°C 中。
2. 单细胞悬液的制备
   1. 培养和处理胶质瘤细胞
      1. 在 37°C 和 5% CO₂ 下，在补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 10 μg/mL 链霉素的 DMEM-Ham F-12 培养基中培养 U251 MG 细胞。
      2. 使用 1 mL 胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，并使用含 FBS 的 DMEM-Ham F-12 培养基中和胰蛋白酶。收集在 15 mL 试管中，以 300 x g 离心 4 分钟，吸出培养基，并以 2 x 10⁵ 个细胞/mL 的浓度悬浮在 1x PBS 中。
         注意:细胞样品应在开始检测前立即制备，所有样品应在黑暗或昏暗的环境中处理，以防止 DNA 因光线而受损。
      3. 将细胞悬液与 1% 熔融低熔点琼脂糖（在 37°C）中以 1:10 （v/v） 的比例混合，上下移液轻轻混匀，然后立即将 30 μL 移液到琼脂糖包被的载玻片上。使用移液器吸头的侧面铺开琼脂糖/细胞混合物，以确保形成薄层。
      4. 将载玻片平放在 4°C 下避光 10 分钟。将胶凝时间增加到 30 分钟可以提高样品在高湿度环境中的粘附性。
      5. 将载玻片浸入 4°C LS 中，在黑暗中浸泡 1 小时至过夜。
3. 单细胞电泳
   1. 用于碱性彗星测定
      1. 轻轻地从 LS 中取出载玻片，排干多余的缓冲液，并在 4°C 下轻轻浸入 AES 中 1 小时，以允许 DNA 解旋。将载玻片放在黑暗中。
      2. 在电泳载玻片托盘中加入预冷的 AES，不要在载玻片上方不超过 0.5 cm（这取决于电泳装置的大小），将载玻片放入其中并盖上盖子。将电源电压设置为 1 V/cm（电极之间的长度），并在 4°C 下运行 30 分钟。
      3. 从载玻片中排出多余的电泳溶液。在室温下将载玻片在 dH₂O 中轻轻浸入两次，每次 5 分钟。
      4. 在室温下将玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 5 分钟。继续染色。
4. Stain Comet 载玻片
   1. 在 37°C 下避光干燥玻片 10 - 15 分钟。
   2. 将 50 - 100 μL 绿色荧光核酸染色溶液置于每个干燥的琼脂糖上，并在室温下避光染色 15 分钟。
   3. 在 dH₂O 中短暂冲洗载玻片，并在 37°C 下避光完全干燥。继续进行图像采集和分析。

Materials