碱性单细胞凝胶电泳：一种用于化疗后单个癌细胞DNA损伤定量检测的高灵敏度技术

摘要

来源：Lu, Y., 等 评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤 视频实验杂志 (2017)

在本视频中，我们演示了一种碱性单细胞凝胶电泳实验方法，用于定量检测经阿霉素处理的细胞中单链和双链DNA断裂。在碱性条件下，DNA碱基对之间的氢键被破坏，导致DNA双链完全解旋和分离。在电泳过程中，未损伤和已损伤的DNA片段在琼脂糖凝胶中发生差异迁移，形成彗星状结构：迁移较慢的未损伤DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的损伤DNA片段则形成拉长的彗星尾部。

方案

1. 准备试剂

1. 1x PBS
   1. 将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释，并使用 pH 计调节 pH 至 7.4。室温保存。
2. 裂解液 (LS)
   1. 在 900 mL dH₂O 中配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计调节 pH 至 10。加入 1% 月桂酰基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，并定容至 1,000 mL。使用前于 4°C 冷却至少 30 分钟。
3. 碱性电泳液 (AES)，pH >13
   1. 在 800 mL dH₂O 中配制 200 mM NaOH 和 1 mM 二钠 EDTA。调节 pH 并确保其 pH >13。定容至 1,000 mL。使用前新鲜配制，并于 4°C 冷却至少 30 分钟。
4. 染色液
   1. 将 1 μL 10,000 倍绿色荧光核酸染料 (例如，SYBR Green) 加入 30 mL Tris-EDTA 缓冲液 (10 mM Tris-HCl, 1 mM 二钠 EDTA, pH 7.4) 中，4°C 保存。避光。
5. 1% 低熔点琼脂糖
   1. 在微波炉中熔化 1% 低熔点琼脂糖 (1 g 加入 100 mL dH₂O 中)。每 15–20 秒轻轻摇晃琼脂糖，确保其完全熔化。使用前置于 37°C 水浴中至少 20 分钟。
6. 预热移液器吸头
   1. 将 P200 移液器吸头尖端剪去 3 mm，并在吸取琼脂糖前于 37°C 预热。

2. 准备彗星电泳载玻片

1. 载玻片包被
   1. 融化1%琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）₂在微波炉中加热 2 - 3 分钟，直至琼脂糖完全熔化。将玻璃载玻片浸入琼脂糖中，然后用无绒擦拭纸擦拭载玻片的一面。
   2. 将载玻片平放在平坦表面晾干，或在50°C下加热以加快干燥；干燥后应形成一层透明的琼脂糖薄膜。使用前将包被的载玻片置于37°C环境中。
2. 单细胞悬液的制备
   1. 胶质瘤细胞的培养与处理
      1. 在添加了10% FBS、100 U/mL青霉素和10 μg/mL链霉素的DMEM-Ham F-12培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养U251 MG细胞。₂.
      2. 使用1 mL胰蛋白酶消化细胞3分钟，用含FBS的DMEM-Ham F-12培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集至15 mL离心管中，300 × g离心4分钟，吸除上清液，用培养基重悬细胞至浓度为2 × 10⁶个/mL⁵ 细胞/mL，溶于1×PBS中。
         注意： 细胞样品应在使用前立即制备  开始实验时，所有样品均应在避光或弱光环境中操作，以防止光照导致DNA损伤。
      3. 将细胞悬液与1%熔化的低熔点琼脂糖（37°C）按1:10（v/v）的比例混合，轻轻吹打混匀，立即吸取30 μL滴加至琼脂糖包被的载玻片上。用移液器吸头侧面将琼脂糖/细胞混合物铺展，确保形成一层薄层。
      4. 将载玻片平放在4°C避光环境中10分钟。将凝胶时间延长至30分钟可提高样品在高湿度环境中的附着性。
      5. 将载玻片浸入4°C LS中，避光孵育1小时至过夜。
3. 单细胞电泳
   1. 用于碱性彗星试验
      1. 从LS中轻柔取出载玻片，沥去多余缓冲液，再轻柔浸入AES中，于4°C孵育1小时，以使DNA解链。孵育过程中需避光保存。
      2. 将预冷的AES加入电泳载玻片槽中，液面高度不得超过载玻片上方0.5 cm（具体取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设定为1 V/cm（电极间距离），在4°C条件下电泳运行30分钟。
      3. 从载玻片上沥干多余的电泳液。将载玻片轻轻浸入去离子水两次。₂室温下每次5分钟。
      4. 将载玻片轻轻浸入70%乙醇中，室温下孵育5分钟。随后进行染色。
4. 染色彗星实验载玻片
   1. 在避光条件下，于37°C干燥载玻片10 - 15分钟。
   2. 将50–100 μL绿色荧光核酸染色液加至每块干燥的琼脂糖凝胶上，室温避光染色15分钟。
   3. 用 dH₂O 快速冲洗载玻片₂在37°C避光条件下干燥并完全晾干。随后进行成像采集与分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS（无 Ca++、Mg++）	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma 碱	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
月桂酰肌氨酸钠	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
SYBR Green	Invitrogen	S33102
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520
琼脂糖	Invitrogen	16500
95% 乙醇	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
胰蛋白酶	GIBCO	25300-054
玻璃组织切片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes 纸巾	KIMberly-Clark
1.5 mL 微量离心管	DENVILLE
移液器吸头	SHARP
微波炉	Avanti
水浴锅	PRECISION
水平电泳槽	TREVIGEN	Cometassay ES II
电源	Bio-Rad
培养箱	Quincy Lab	Model 12-140E
荧光显微镜	Zeiss	LSM700
微量移液器	Eppendorf