基于微流控毛细管电泳的PCR产物片段长度分析：一种基于微芯片的按大小分离DNA片段的电泳分离技术

摘要

来源：Wang, H., Zhu et al. 一种基于聚合酶链式反应的稳定检测方法用于定量脆性X智力低下基因-1中胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复序列. J. Vis. Exp. (2019).

本视频介绍了基于片段大小分离PCR扩增子的微流控毛细管电泳技术。该技术利用荧光染料和标准分子量标记物进行片段长度分析。

方案

1. PCR 产物的片段大小分析

1. 开始前，将DNA染料浓缩液、DNA凝胶基质、DNA标记物、DNA标准品及纯化后的DNA样品在室温下平衡30分钟。
2. 设置上样工作站
   1. 使用新批次的试剂时，需更换注射器（参见材料表）。
   2. 调整底板，松开注射器夹的杠杆，并将其向上滑动至顶部位置。
3. 启动片段分析软件（参见材料表），并配制凝胶-染料混合液。
4. 将染料浓缩液涡旋震荡10秒后离心。向一支凝胶基质小瓶中加入25 μL染料，充分涡旋混匀后离心。
   1. 将凝胶-染料混合液转移至离心过滤器中。将离心过滤器放入微量离心机，在室温下以1,500 × g ± 20% 离心10分钟。
      注意： 含染料的溶液需避光保护，使用后于4 °C保存。配制好的凝胶-染料混合液可使用约15次芯片。每次使用前需将其在室温下平衡30分钟。
5. 加载凝胶-染料混合液
   1. 在上样工作站上插入新的DNA芯片。向标有“G”的孔中加入9 μL凝胶-染料混合液。请确保推杆位于1 mL刻度处，然后关闭上样工作站。
   2. 将注射器推杆缓慢下压，直至被夹子固定。准确等待30秒后释放夹子，再等待5秒，然后缓慢将推杆拉回至1 mL位置。
   3. 打开上样工作站，向所有标有“G”的孔中各加入9 μL凝胶-染料混合液。
6. 向标有梯形符号的孔中加入5 μL标记物，同时向其余12个样品孔中各加入5 μL标记物。不得留有任何空孔。
7. 向标有梯形符号的孔中加入1 µL DNA标准品。向已使用的12个样品孔中各加入1 µL PCR产物，或向未使用的孔中各加入1 µL超纯水。将芯片水平放置于涡旋混合器的适配器中，在指定设置（2,400 rpm）下涡旋震荡1分钟。
8. 将芯片插入生物分析仪仪器中，并在5分钟内启动运行。
9. 检测完成后，立即从仪器中取出已使用的芯片。
10. 向电极清洗液的一个孔中缓慢加入350 μL去离子水。打开生物分析仪的盖子，将电极清洗器放入其中，关闭盖子并孵育约10秒。打开盖子取出电极清洗器，再等待10秒使电极上的水分蒸发，然后关闭盖子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：0.2 mL PCR 管	Axygen	PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：1x TE 缓冲液，pH 8.0，RNase-free	Ambion	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：2100 Bioanalyzer 仪器	Agilent	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：96 孔 PCR 板	Thermo Fisher	AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：电极盒	Agilent		提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：IKA 涡旋混合器	Agilent		提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：Sizing 软件 2100 Expert 软件	Agilent		提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：检测芯片	Agilent		提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备
Agilent DNA 7500 试剂盒	Agilent	5067-1506	用于片段大小分析
Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 Ladder（黄色盖）	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 标记物（绿色盖）	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 芯片	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 染料浓缩液（蓝色盖）	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 凝胶基质小瓶（红色盖）	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：电极清洁剂	Agilent		包含于试剂盒：Agilent DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：离心过滤器	Agilent		Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506）
Agilent DNA 7500 试剂盒：注射器	Agilent		Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506）
芯片预处理站	Agilent	5065-4401	提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备
滤板真空装置：MultiScreenHTS 真空装置	Merck Millipore	MSVMHTS00	用于 PCR 产物纯化的滤板真空装置的真空仪器
滤板真空装置：硅胶塞	Merck Millipore	XX2004718	滤板真空装置
滤板真空装置：真空泵	Merck Millipore	WP6122050	滤板真空装置
滤板真空装置：废液收集瓶	Merck Millipore	XX1004705	滤板真空装置