非还原性SDS-PAGE：一种分析二硫键连接的多聚体蛋白复合物的方法

摘要

来源：Rotoli, S. M. 等，结合非还原性SDS-PAGE分析与化学交联技术检测培养哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚体复合物。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了通过非还原性SDS-PAGE分离蛋白质样品以分析多聚体蛋白质复合物的技术。该技术可保留由二硫键连接的蛋白质多聚体亚基，后续可进一步通过蛋白质印迹法进行分析。

方案

1. 使用碘乙酰胺封闭游离半胱氨酸残基

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清和1%丙酮酸钠的高糖最低必需培养基，将U-2 OS细胞培养至6 cm² 培养皿中细胞融合度达到50%–60%。
2. 使用前新鲜配制10 mM碘乙酰胺储备液，剩余试剂用后立即弃去。
3. 将碘乙酰胺直接加入细胞培养基中，使其终浓度为0.1 mM，在室温下轻轻摇动培养皿2分钟。

2. 收集细胞

1. 吸弃细胞培养液。
2. 用 5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。吸弃最后一次 PBS 洗涤液，然后加入 1 mL 冷 PBS。
3. 使用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下。用 1 mL 移液器吸取 PBS 和细胞悬液，并将全部液体转移至 1.5 mL 微量离心管中。
4. 在 4 °C 条件下，以 7,500 x g 离心 3 分钟。吸弃 PBS，保留细胞沉淀。细胞沉淀可在 -80 °C 保存至后续处理。

3．蛋白质提取

1. 用ddH₂O配制100 µL的1x裂解缓冲液（见 材料表）。使用前立即加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为1 mM。
2. 将50 µL的1x裂解缓冲液直接加入细胞沉淀中并悬浮细胞。冰上孵育5分钟。
3. 使用超声破碎仪以40%的恒定脉冲模式超声处理8秒（超声仪信息见 材料表 ；不同超声仪可根据需要调整参数），期间保持提取物处于冰上。
4. 在4 °C、16,000 x g条件下离心提取物5分钟。上清液即为可溶性蛋白组分。如需，可进行Bradford分析以测定蛋白浓度。

4．样品制备

1. 取10 µL可溶性蛋白提取物，加入10 µL 1x Laemmli SDS上样缓冲液（含4% SDS、20%甘油、0.004%溴酚蓝和0.125 M Tris-HCl，pH 6.8）。不要添加任何还原试剂。
2. 若当天进行SDS-PAGE分析，样品应置于冰上保存；如需长期储存，可于-20 °C保存。上样前，将样品在85 °C加热5分钟。

5. U-2 OS 细胞中内源性蛋白质的体内甲醛交联

1. 将U-2 OS细胞在175 cm² 培养瓶中培养至70%–80%汇合度。
2. 进行甲醛交联反应
   1. 在通风橱中，取市售的37%甲醛溶液，直接加入培养基中，使终浓度为1%，室温下轻柔振荡孵育15分钟。
   2. 加入1.25 M甘氨酸至终浓度0.125 M以终止反应，室温下在摇床上轻柔振荡孵育5分钟。
3. 用5 mL预冷的PBS洗涤细胞三次。吸除最后一次PBS洗涤液后，加入10 mL PBS，用细胞刮刀将细胞从培养瓶底部刮下。
4. 用10 mL移液管吸取PBS和细胞悬液，将全部液体转移至15 mL锥形离心管中，在4 °C下以500 x g 离心2分钟。吸除PBS，保留细胞沉淀。

6. 细胞核的分级分离

1. 配制10 mL匀浆缓冲液：0.25 M蔗糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES和0.5% BSA，pH调至7.4。使用前立即加入PMSF至终浓度为1 mM，并加入3 mL核悬浮缓冲液（含0.1% Triton X-100的PBS）。
2. 将5 mL匀浆缓冲液直接加入细胞沉淀中，充分悬浮。在4 °C下以500 × g 离心2分钟，弃去上清液。
3. 用5 mL匀浆缓冲液重悬沉淀。使用紧密配合的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，在10次冲程/500 rpm条件下匀浆细胞。
4. 在4 °C下以1,500 × g 离心10分钟，弃去上清液。
   注意： 可将上清液在10,000 × g 离心10分钟，用于分离线粒体。
5. 用1 mL核悬浮缓冲液重悬沉淀，冰上孵育10分钟。
6. 在600 × g 下离心10分钟，弃去上清液。
7. 用1 mL核悬浮缓冲液重悬沉淀，再次离心，弃去上清液。最终所得沉淀即为分离的细胞核。

7. 蛋白质提取

1. 重复第4节操作，但将25 µL的1x裂解缓冲液直接加入细胞沉淀中，然后重悬。

8. 样品制备

1. 取10 µL可溶性蛋白提取物，分别制备两份SDS-PAGE样品，各加入10 µL 2x Laemmli SDS样品缓冲液和1 µL 2-巯基乙醇（BME）。
2. 将其中一份样品在37 °C加热5分钟，另一份在98 °C加热15分钟，以逆转甲醛交联。

9．SDS-PAGE 分析

1. 配制 1 L 的 1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% (w/v) SDS）。
2. 安装 SDS-PAGE 电泳装置。
   注意： 本实验方案使用 16% 预制 TGX SDS-Page 凝胶。值得注意的是，可使用任意浓度的凝胶。
   1. 根据制造商说明书，打开凝胶储存包装并取出凝胶盒。
   2. 移除填充加样孔的梳子以及凝胶盒底部的封条。
   3. 将凝胶放入电泳装置中。
   4. 向内槽加入 1× 电泳缓冲液，直至加样孔完全浸没于液体中。使用塑料移液器用运行缓冲液冲洗加样孔。
3. 在凝胶上加样，并同时加入 10 µL 预染标准蛋白 Marker。
4. 以 200 V 电压电泳，直至染料前沿距凝胶底部约 1 cm 处。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 预制 TGX 凝胶	ThermoFisher	Xp00160
溴酚蓝
BSA	Cell signaling	99985
细胞裂解缓冲液	Cell signaling	9803
离心机	Eppendorf	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
EDTA	Sigma Aldrich	M101
电泳装置	Invitrogen	A25977
胎牛血清	Gibco	1932693
甲醛	ThermoFisher	28908
玻璃-聚四氟乙烯匀浆器
甘油	Sigma Aldrich	65516
甘氨酸	RPI	636050
HEPES	Sigma Aldrich	H0527
碘乙酰胺	ThermoFisher	90034
PBS	Sigma Aldrich	P3813
电源	Biorad	200120
预染蛋白 Marker	ThermoFisher	26619
SDS	Biorad	161-0302
超声破碎仪	Branson	450
Tris 碱	RPI	T60040
Tris 缓冲盐水	Sigma Aldrich	SRE0031	含 Tween 20，pH 7.5
Tris-甘氨酸电泳缓冲液	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
U-2 OS	ATCC	HTB-96