非还原性 SDS 页面:一种分析二硫键连接的多聚体蛋白复合物的方法

摘要

来源:Rotoli， SM et al.， 结合非还原性 SDS-PAGE 分析和化学交联检测培养物中哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚体复合物。J. Vis. Exp.（2019 年）。

该视频介绍了通过非还原 SDS-PAGE 分离蛋白质样品以分析多聚体蛋白质复合物的技术。该技术保留了由二硫键保持的蛋白质多聚体亚基，稍后可以通过蛋白质印迹进行分析。

方案

1. 使用碘乙酰胺封闭游离半胱氨酸残基

1. 在 37 °C 的 5% CO₂ 中，将 U-2 OS 细胞在 6 cm² 培养皿中培养至 50%–60% 汇合度，在含有 10% 胎牛血清和 1% 丙酮酸钠的高葡萄糖培养基中
。
2. 使用前制备 10 mM 碘乙酰胺的新鲜储备液，然后丢弃任何未使用的试剂。
3. 将 0.1 mM 终浓度的碘乙酰胺直接添加到细胞培养基中。在室温下轻轻摇动培养皿 2 分钟。

2. 收获细胞

1. 从细胞中吸出培养基。
2. 用 5 mL 冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞 3 次。吸出最终的 PBS 洗涤液，然后加入 1 mL 冷 PBS。
3. 使用细胞刮刀从培养皿底部刮下细胞。使用 1 mL 移液器吸取 PBS 和细胞悬液，并将所有液体分配到 1.5 mL 微量离心管中。
4. 在 4 °C 下以 7,500 x g 旋转细胞 3 分钟。吸出 PBS，留下细胞沉淀。细胞沉淀可以储存在 -80 °C 直至加工

3.蛋白质提取

1. 制备 100 μL 用 ddH₂

材料