液相等电聚焦：一种从粗制 Gymnema sylvestre 提取物中分离生物活性分子的电泳技术

摘要

来源：Veerapandian, R.，等。利用制备型等电聚焦（IEF）方法从天然来源中分离生物活性小分子、多肽及从微生物中分离蛋白质。视觉化实验杂志（2020年）。

本视频介绍了一种利用液相等电聚焦技术从植物提取物中分离复杂分子的方法。该技术有助于在天然状态下纯化复杂的生物大分子，可用于多种后续应用。

方案

1. 从 Gymnema sylvestre 提取物中分离和纯化小分子及多肽

1. 称取0.6 g植物提取物，加入蒸馏水（60 mL）中，在滚轴混合仪上混合5分钟使其溶解。
   注意：任何可溶且无盐的生物样品均可用于液相等电聚焦（IEF）仪器进行分离与纯化。缓冲盐浓度不超过10 mM的样品也可使用，但分辨率略有降低。
2. 将溶解后的植物提取物在10,000 × g 条件下离心5分钟，以去除不溶性颗粒。
3. 将上清液（约60 mL）转移至80 mL离心管中，并加入0.6 mL两性电解质（pH 3-10），使其终浓度为1%（v/v）。
4. 准备液相IEF装置。
   1. 根据说明书（材料表）将液相IEF电极（阳极-红色按钮，阴极-黑色按钮）与其相应的离子交换膜组装。若使用新膜，需用0.1 M NaOH平衡阴离子交换膜，用0.1 M H₃PO₄平衡阳离子交换膜，时间至少16小时。
   2. 两次运行之间，将膜保存在电解液（0.1 M NaOH 或 0.1 M H₃PO₄）中，避免干燥。
   3. 通过使离子交换垫片上的三个椭圆形孔对齐，组装电极的内、外部分。向电极中加入相应电解液（约25–30 mL），....

结果

图1：液相等电聚焦装置设置及G. sylvestre植物提取物的组分分离。（A）运行过程中，（B）组分收集过程中，（C）组分收集完成后，（D）液相等电聚焦装置各部件：1）离子交换膜，2）聚焦室及膜芯，3）电极组件（负极），4）电极组件（正极）。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 注射器滤器	Fisher Scientific	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 两性电解质	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 两性电解质	Bio-Rad	163-1192
紧凑型低温恒温器	Lauda-Brinkmann	RM 6T	将水冷温度设定为 4°C，设备可在低至 0°C 的条件下运行；当冷却水通过 Rotofor 冷却芯时，循环水温将约为 5°C 或更高，具体取决于所施加的电压。
匙羹藤植物叶提取物粉末（>25% 钩藤酸）	Suan Farma, NJ USA
Mini Protean 电泳仪	Bio-Rad
pH 计	Mettler Toledo	S20	用于测定 Rotofor（液相等电聚焦）各组分的 pH 值
Rotofor 电泳仪	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf（Rotofor 装配说明书）
RPMI-1640 培养基	HyClone	DH30255.01
密封胶带	Bio-Rad	170-2960	也可使用透明胶带
Sorvall Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific	75002432