液相等电聚焦:一种从粗匙羹藤提取物中分离生物活性分子的电泳技术

1. 从匙羹藤提取物中分离纯化小分子和多肽

1. 量取 0.6 g 植物提取物，在滚轮管中混合 5 min.
   溶解在蒸馏水 （60 mL） 中 注:任何可溶性且不含盐的生物样品都可用于使用液相等电聚焦 （IEF） 仪器进行分离和纯化。缓冲盐浓度高达 10 mM 的样品可以使用，分离度略有降低。
2. 将溶解的植物提取物以 10,000 x g 离心 5 分钟以去除不溶性颗粒。
3. 将上清液 （~60 mL） 转移到 80 mL 离心管中，并与 0.6 mL 两性电解液 （pH 3-10） 混合至 1% （v/v）。
4. 准备液相 IEF 装置。
   1. 根据说明手册（材料表），将液相 IEF 电极（阳极红色按钮和阴极黑色按钮）与其各自的交换膜组装在一起。当使用新膜时，用 0.1 M NaOH 平衡阴离子交换膜，用 0.1 M H₃PO₄ 平衡阳离子交换膜至少 16 小时。
   2. 在两次运行之间将膜储存在电解质（0.1 M NaOH 或 0.1 M H₃PO₄）中，不要让其变干。
   3. 通过在离子交换垫圈上对齐三个长方形孔来组装电极的内部和外部。用相应的电解质 （~25-30 mL） 填充电极，以防止其膜变干。
   4. 请勿添加过量（超过电极室体积的 1/3）电解液，否则可能会在电极内部积聚压力并导致泄漏。
   5. 用仪器组件部件随附的密封胶带覆盖样品采集端口（材料表）。样品收集端口侧可以通过两个垂直金属对准销来识别。或者，使用标准密封胶带密封端口。
   将
   6. 聚焦室组件的所有部分（阳极电极、尼龙膜芯、聚焦室和阴极电极）依次组装在陶瓷冷却指上。
   7. 使用 50 mL 注射器向聚焦室中注入预冷的蒸馏水（标准 IEF 池的总体积为 60 mL）。
   8. 将液相 IEF 仪器连接到 4 ºC 的循环冷却水中，并以 15 W 和 3,000 V 预运行装置 3-5 分钟或直到电压稳定><下来。 注意: 通常，在一分钟内，电压将达到最大设定值。用蒸馏水进行预运行有助于去除聚焦室和尼龙膜芯中的残留离子。
   9. 关闭电源并使用馏分收集器从池中去除水。用密封胶带重新密封收集端口。腔室现在已准备好加载样品。
5. 使用带有 1-1/2 英寸 19 G 平头针头（仪器随附）的 50 mL 注射器，并通过样品采集端口将制备好的样品与两性电解质（总共 60 mL）一起加载到池中。
6. 从支架上取下聚焦池并敲击电极室以去除气泡，以去除样品池中的气泡。气泡的存在会导致电压和电流波动并影响运行。
7. 将装置连接到水冷却剂 （4 °C），并在电源恒定 15 W 的情况下开始分馏。
8. 运行设备 3 小时或直到电压达到恒定值。
   注:当样品开始聚焦时，电压将开始逐渐上升，直到达到恒定值。
9. 运行后，按下 IEF 装置中的收获按钮 ON，准备收集连接到真空泵的收获箱（包含 20 个塑料管，12 mm x 75 mm，体积为 5-6 mL）中的馏分。
10. 将 20 个收集针与用胶带密封的聚焦池的 20 个收集端口对齐。
11. 将收集针推入密封带，同时开启真空泵（图1B，1C和1D）
    注意:每次将每个腔室中约 3 mL 馏分收集到试管中。馏分可用于后续下游应用（用于肽定量的 SDS-PAGE、用于小分子的 TLC 和生物测定）。

图 1:液相 IEF 装置设置和 G. sylvestre 植物提取物的分级分离。（A） 在运行过程中，（B） 在馏分收集过程中，（C） 在馏分收集过程中，以及 （D） 液相 IEF 装置部件，1） 离子交换膜，2） 聚焦室和膜芯，3） 电极组件（负极），4） 电极组件（正极）。