液相等电聚焦：一种从粗制 Gymnema sylvestre 提取物中分离生物活性分子的电泳技术

摘要

来源：Veerapandian, R.，等。利用制备型等电聚焦（IEF）方法从天然来源中分离生物活性小分子、多肽及从微生物中分离蛋白质。视觉化实验杂志（2020年）。

本视频介绍了一种利用液相等电聚焦技术从植物提取物中分离复杂分子的方法。该技术有助于在天然状态下纯化复杂的生物大分子，可用于多种后续应用。

方案

1. 从 Gymnema sylvestre 提取物中分离和纯化小分子及多肽

1. 称取0.6 g植物提取物，加入蒸馏水（60 mL）中，在滚轴混合仪上混合5分钟使其溶解。
   注意：任何可溶且无盐的生物样品均可用于液相等电聚焦（IEF）仪器进行分离与纯化。缓冲盐浓度不超过10 mM的样品也可使用，但分辨率略有降低。
2. 将溶解后的植物提取物在10,000 × g 条件下离心5分钟，以去除不溶性颗粒。
3. 将上清液（约60 mL）转移至80 mL离心管中，并加入0.6 mL两性电解质（pH 3-10），使其终浓度为1%（v/v）。
4. 准备液相IEF装置。
   1. 根据说明书（材料表）将液相IEF电极（阳极-红色按钮，阴极-黑色按钮）与其相应的离子交换膜组装。若使用新膜，需用0.1 M NaOH平衡阴离子交换膜，用0.1 M H₃PO₄平衡阳离子交换膜，时间至少16小时。
   2. 两次运行之间，将膜保存在电解液（0.1 M NaOH 或 0.1 M H₃PO₄）中，避免干燥。
   3. 通过使离子交换垫片上的三个椭圆形孔对齐，组装电极的内、外部分。向电极中加入相应电解液（约25–30 mL），以防止其膜干燥。
   4. 切勿加入过量电解液（超过电极腔体积的1/3），以免电极内部压力升高导致泄漏。
   5. 使用仪器配套的密封胶带覆盖样品收集口（材料表）。样品收集口一侧可通过两个垂直的金属对准销识别。也可使用标准密封胶带密封各端口。
   6. 按顺序将聚焦室组件各部分（阳极电极、尼龙膜芯、聚焦室和阴极电极）组装在陶瓷冷却指上。
   7. 使用50 mL注射器向聚焦室中加入预冷的蒸馏水（标准IEF池总容量为60 mL）。
   8. 将液相IEF仪器连接至4 ºC循环冷却水系统，并以15 W、3,000 V预运行3–5分钟，或直至电压稳定。
      注意：通常在1分钟内电压即可达到设定最大值。使用蒸馏水预运行有助于去除聚焦室和尼龙膜芯中的残留离子。
   9. 关闭电源，使用馏分收集器将池中的水排出。用密封胶带重新封住收集口。此时腔室已准备好加样。
5. 使用配备1-1/2英寸19 G钝头针（随仪器提供）的50 mL注射器，通过样品收集口将已加入两性电解质的样品（总体积60 mL）注入池中。
6. 将聚焦池从支架上取下，轻敲电极室以排除样品池中的气泡。气泡的存在会导致电压和电流波动，影响运行效果。
7. 将装置连接至4 °C水冷系统，并以恒定功率15 W开始分馏。
8. 运行设备3小时，或直至电压达到稳定值。
   注意：随着样品开始聚焦，电压将逐渐上升，直至达到恒定值。
9. 运行结束后，准备在收获盒（含20个塑料管，12 mm × 75 mm，容量5–6 mL）中收集馏分，该盒通过按下IEF单元上的收获按钮ON与真空泵连接。
10. 将20个收集针与用胶带密封的聚焦池上的20个收集口对齐。
11. 将收集针刺穿密封胶带，同时开启真空泵ON（图1B、1C & 1D）。
    注意：每次将从每个腔室收集约3 mL的馏分至各试管中。所得馏分可用于后续下游应用（如SDS-PAGE用于肽定量，TLC和生物活性检测用于小分子分析）。

结果

图1：液相等电聚焦装置设置及G. sylvestre植物提取物的组分分离。（A）运行过程中，（B）组分收集过程中，（C）组分收集完成后，（D）液相等电聚焦装置各部件：1）离子交换膜，2）聚焦室及膜芯，3）电极组件（负极），4）电极组件（正极）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 注射器滤器	Fisher Scientific	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 两性电解质	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 两性电解质	Bio-Rad	163-1192
紧凑型低温恒温器	Lauda-Brinkmann	RM 6T	将水冷温度设定为 4°C，设备可在低至 0°C 的条件下运行；当冷却水通过 Rotofor 冷却芯时，循环水温将约为 5°C 或更高，具体取决于所施加的电压。
匙羹藤植物叶提取物粉末（>25% 钩藤酸）	Suan Farma, NJ USA
Mini Protean 电泳仪	Bio-Rad
pH 计	Mettler Toledo	S20	用于测定 Rotofor（液相等电聚焦）各组分的 pH 值
Rotofor 电泳仪	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf（Rotofor 装配说明书）
RPMI-1640 培养基	HyClone	DH30255.01
密封胶带	Bio-Rad	170-2960	也可使用透明胶带
Sorvall Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific	75002432