迁移率变化亲和毛细管电泳:一种根据蛋白质-配体复合物的差异迁移分析样品-配体相互作用的方法

摘要

来源:Nachbar M. et al.， 通过毛细管凝胶电泳和亲和毛细管电泳分析 AtHIRD11 内在无序和与金属离子的结合。J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频介绍了通过迁移率变化亲和毛细管电泳分析蛋白质-配体相互作用的方法。该方法可用于表征蛋白质与各种带电配体的结合行为。

方案

1. 准备 ACE 分析的解

1. 准备 1 M NaOH 溶液。
   1. 在 100 mL 容量瓶中称取 4.0 g NaOH。
   2. 用去离子水将其填充至标记处，制成 1 M 原液。
2. 在 0.1 M NaOH 溶液中制备 0.1 M 乙二胺四乙酸 （EDTA）。
   1. 使用 10 mL 球形移液管在 100 mL 容量瓶中转移 10 mL 0.1 M NaOH。用去离子水将其填充至标记处。
   2. 在称量舟上称取 2.42 g EDTA，并将固体化合物溶解在 100 mL 的 0.1 M NaOH 中。
3. 准备 Tris 缓冲液 （30 mM） 溶液。
   1. 在 500 mL 烧杯中加入 3.63 g Tris、200 mL 去离子水和搅拌棒。将烧杯放在搅拌板上并打开。
   2. 将 pH 计电极放入烧杯中，并使用 0.1 M HCl 将 pH 调节至 7.4。
   3. 将溶液填充到 1 L 容量瓶中，然后用去离子水填充至刻度。
      注:必须重复此过程，或者需要更大的容量瓶，因为整个分析需要超过 1 L。
4. 制备乙酰苯胺电渗流 （EOF） 标志物 （60 μM） 溶液。
   1. 在 100 mL 容量瓶中加入 6 mg 乙酰苯胺和 100 mL Tris 缓冲液。
   2. 将容量瓶放入超声波浴中并打开 30 分钟。
5. 制备样品 （1 mg/mL） 溶液。
   1. 将 0.5 mL 微量离心管放在精密天平上，向管中加入 0.3 mg 冻干 AtHIRD11 粉末。
   2. 使用微量移液器在试管中加入 0.3 mL 的 30 mM Tris 缓冲液 （pH 7.4）。小心摇动试管以溶解蛋白质。
6. 准备配体溶液。
   1. 制备 CaCl₂ （5 mM） 储备液。
      1. 取一个称量船，将其放在分析天平上，称取 36.76 mg CaCl₂*H₂O。
      2. 使用微量移液器，将称量舟中的 CaCl₂*H₂O 冲洗到 50 mL 容量瓶中，加入预先制备的 Tris 缓冲液。
      3. 用 Tris 缓冲液填充容量瓶直至标记。
   2. 准备剩余的储备溶液 （5 mM）。
      1. 重复步骤 1.6.1，使用其他金属盐代替 CaCl₂*H₂O [MgCl₂:23.80 mg，BaCl₂:26.02 mg，Sr（NO₃）₂:52.91 mg，MnCl₂:31.46 mg，SeCl₄:52.91 mg，CoCl₂*2H₂O:41.47 mg，CuCl₂*2H₂O:42.62 mg，ZnCl₂:3.41 mg，和 NiCl₂*6H₂O: 59.43 毫克].
         注意:ZnCl₂ 溶液的浓度为 0.5 mM。由于观察到离子与毛细管内壁之间的强相互作用，因此浓度降低了 10⁴ 倍。
   3. 制备 500 μM CaCl₂ 溶液。
      1. 填充 10 mL CaCl₂ 储备液，并将其放入 100 mL 容量瓶中。
      2. 用 Tris 缓冲液填充容量瓶至标记并摇动培养瓶。
   4. 制备 250 μM CaCl₂ 溶液。
      1. 填充 5 mL CaCl₂ 储备液，并将其放入 100 mL 容量瓶中。
      2. 用 Tris 缓冲液填充容量瓶至标记并摇动培养瓶。
   5. 对其他 Stock 溶液重复前面的步骤。
7. 将溶液填充到小瓶中。
   注意:每次重复运行都需要一组入口和出口样品瓶。在入口和出口处使用新鲜的配基溶液可减少每次运行后迁移时间的变化。
   1. 将 250 μM CaCl₂ 溶液填充到 10 mL 注射器中。
   2. 将 0.22 μm PVDF 过滤器放在注射器上，并使用注射器将 2 mL 溶液推入过滤器，以丢弃过滤后的溶液。
   3. 用注射器的剩余 250 μM CaCl₂ 溶液填充 10 个样品瓶，直至达到最大允许体积。将每个标记为 250 μM CaCl₂ 溶液入口样品瓶。
   4. 填充 10 个样品瓶，直到它们被 250 μM CaCl₂ 溶液半填充。将每个标记为 250 μM CaCl₂ 溶液出口小瓶。
   5. 对其他含金属盐的溶液重复步骤 1.7.1 - 1.7.4。
   6. 使用 30 mM Tris 缓冲液 （pH 7.4） 溶液对每对入口和出口样品瓶重复上述步骤。
      注意:在两次运行之间使用 30 mmol/L 的 Tris 缓冲液 pH 7.4，以获得在没有金属离子的情况下蛋白质的迁移时间数据。有必要忽视 EOF 的变化。
   7. 对使用乙酰苯胺 EOF 标记物 （60 μM） 溶液的一个小瓶重复上述步骤。此外，使用样品 （1 mg/mL） 溶液重复这些步骤。

2. 亲和毛细管电泳分析

1. 调节毛细管
   1. 将恒温器设置为 23 °C.
      注意:该温度根据已发布的协议使用，并且可以更改为其他温度。但是，交互作用取决于温度，并且会相应地发生变化。
   2. 用 0.1 M NaOH 在 2.5 bar 下冲洗毛细管 40 分钟。
   3. 用去离子水在 1.0 bar 下冲洗毛细管 10 分钟。
   4. 用 30 mM Tris 缓冲液 （pH 7.4） 在 1.0 bar 下冲洗毛细管 30 分钟。
2. ACE 方法的准备工作
   1. 准备不含配体的测量方法。
      注意:样品溶液中未添加乙酰苯胺，因为它掩盖了 2 个蛋白质峰。
      1. 用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 用去离子水在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 用 Tris 缓冲液在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 下将乙酰苯胺溶液注入 6 秒，然后将入口和出口样品瓶更换为 Tris 缓冲液样品瓶。
      5. 施加 0.05 bar 2.4 秒，以便将乙酰苯胺溶液从毛细管尖端进一步推入内侧。
      6. 用 10.0 kV 施加 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 重复步骤 2.2.1.1. - 2.2.1.6. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液，并检测所有蛋白质峰。
   2. 准备使用配体进行测量的方法。
      1. 用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 用去离子水在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 用配体溶液在 2.5 bar 下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 下将乙酰苯胺溶液注入 6 秒，然后将入口和出口样品瓶更换为含配体的缓冲液样品瓶。
      5. 施加 0.05 bar 2.4 秒，以便将乙酰苯胺溶液从毛细管尖端进一步推入内侧。
      6. 用 10.0 kV 施加 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液重复步骤 2.2.2.1 - 2.2.2.6，并检测所有蛋白质峰。
   3. 交替重复步骤 2.2.1 和 2.2.2，以计算各种蛋白质 - 金属离子相互作用的电荷大小比的变化。
      1. 每 60 小时将蛋白质溶液更换为新鲜的蛋白质溶液。
         注意:此时，可以暂停实验。对于每种浓度的配体，此过程至少重复 10 次，因为峰模式在每次运行中略有不同。如果溶液使用时间超过 60 小时，则变化会变得太大。

材料