迁移率偏移亲和毛细管电泳：一种基于蛋白质-配体复合物迁移差异分析样品-配体相互作用的方法

摘要

来源：Nachbar M. 等，利用毛细管凝胶电泳与亲和毛细管电泳分析AtHIRD11的内在无序性及其对金属离子的结合能力。视觉化实验杂志（2018年）。

本视频介绍了通过迁移率偏移亲和毛细管电泳分析蛋白质-配体相互作用的方法。该方法可用于表征蛋白质与多种带电配体结合行为的特征。

方案

1. 准备用于ACE分析的溶液

1. 配制 1 M NaOH 溶液。
   1. 在 100 mL 容量瓶中称取 4.0 g NaOH。
   2. 用去离子水定容至刻度线，配制成 1 M 储备液。
2. 配制含 0.1 M 氢氧化钠的 0.1 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
   1. 使用 10 mL 洗耳球移液器将 10 mL 0.1 M NaOH 转移至 100 mL 容量瓶中，再用去离子水定容至刻度线。
   2. 在称量舟中称取 2.42 g EDTA，将固体化合物溶解于 100 mL 0.1 M NaOH 溶液中。
3. 配制 Tris 缓冲液（30 mM）溶液。
   1. 在 500 mL 烧杯中加入 3.63 g Tris、200 mL 去离子水和一个搅拌子。将烧杯置于搅拌器上并开启搅拌。
   2. 将 pH 计电极插入烧杯中，用 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4。
   3. 将溶液转移至 1 L 容量瓶中，并用去离子水定容至刻度线。
      注意：由于整个分析过程所需体积超过 1 L，因此需重复此步骤或使用更大容量的容量瓶。
4. 配制乙酰苯胺电渗流（EOF）标记物（60 µM）溶液。
   1. 在 100 mL 容量瓶中加入 6 mg 乙酰苯胺和 100 mL Tris 缓冲液。
   2. 将容量瓶放入超声波清洗仪中，开启超声 30 分钟。
5. 配制样品（1 mg/mL）溶液。
   1. 将一个 0.5 mL 微量离心管置于精密天平上，加入 0.3 mg 冻干的 AtHIRD11 粉末。
   2. 使用微量移液器向管中加入 0.3 mL 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）。轻轻振荡使蛋白充分溶解。
6. 配制配体溶液。
   1. 配制 CaCl₂ (5 mM) 储备液。
      1. 取一个称量舟，置于分析天平上，称取 36.76 mg CaCl₂*H₂O。
      2. 使用微量移液器将称量舟中的 CaCl₂*H₂O 用先前配制的 Tris 缓冲液冲洗至 50 mL 容量瓶中。
      3. 用 Tris 缓冲液定容至刻度线。
   2. 配制其余金属盐的储备溶液（5 mM）。
      1. 参照步骤 1.6.1，使用其他金属盐替代 CaCl₂*H₂O [MgCl₂：23.80 mg，BaCl₂：26.02 mg，Sr(NO₃)₂：52.91 mg，MnCl₂：31.46 mg，SeCl₄：52.91 mg，CoCl₂*2H₂O：41.47 mg，CuCl₂*2H₂O：42.62 mg，ZnCl₂：3.41 mg，NiCl₂*6H₂O：59.43 mg]。
         注意： ZnCl₂ 溶液的浓度为 0.5 mM。由于观察到离子与毛细管内壁之间存在强相互作用，因此将其浓度降低了 10⁴ 倍。
   3. 配制 500 µM CaCl₂ 溶液。
      1. 取 10 mL CaCl₂ 储备液，转移至 100 mL 容量瓶中。
      2. 用 Tris 缓冲液定容至刻度线，并振荡混匀。
   4. 配制 250 µM CaCl₂ 溶液。
      1. 取 5 mL CaCl₂ 储备液，转移至 100 mL 容量瓶中。
      2. 用 Tris 缓冲液定容至刻度线，并振荡混匀。
   5. 对其他金属盐储备溶液重复上述步骤。
7. 将溶液分装至样品瓶中。
   注意： 每次重复运行均需准备一组进样口和出样口样品瓶。在进样口和出样口使用新鲜的配体溶液，可减少每次运行后迁移时间的偏移。
   1. 用 10 mL 注射器吸取 250 µM CaCl₂ 溶液。
   2. 在注射器前端安装一个 0.22 µm PVDF 滤膜，推动注射器使 2 mL 溶液通过滤膜，弃去该部分滤过溶液。
   3. 用注射器中剩余的 250 µM CaCl₂ 溶液将 10 个样品瓶装至最大允许体积，并标记为 250 µM CaCl₂ 溶液进样口瓶。
   4. 用 250 µM CaCl₂ 溶液将另外 10 个样品瓶填充至半满，并标记为 250 µM CaCl₂ 溶液出样口瓶。
   5. 对其他含金属盐的溶液重复步骤 1.7.1–1.7.4。
   6. 使用 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）溶液重复上述步骤，为每一对进样口和出样口样品瓶分别准备溶液。
      注意： 在两次运行之间使用 30 mmol/L Tris 缓冲液（pH 7.4）以获取无金属离子存在时蛋白的迁移时间数据，这对于排除电渗流（EOF）变化的影响是必要的。
   7. 使用乙酰苯胺 EOF 标记物（60 µM）溶液重复上述步骤，准备一个样品瓶。同样，使用样品（1 mg/mL）溶液重复上述步骤。

2. 亲和毛细管电泳分析

1. 预处理毛细管
   1. 将恒温器设置为 23 °C。
      注意： 温度依据已发表的实验方案设定，可根据需要调整为其他温度。然而，分子间相互作用依赖于温度，相应地也会发生变化。
   2. 用 0.1 M NaOH 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 40 分钟。
   3. 用去离子水在 1.0 bar 压力下冲洗毛细管 10 分钟。
   4. 用 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）在 1.0 bar 压力下冲洗毛细管 30 分钟。
2. ACE 方法的准备工作
   1. 准备不含配体的测量方法。
      注意： 样品溶液中未添加乙酰苯胺，因其会掩盖两个蛋白质峰。
      1. 用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 用去离子水在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 用 Tris 缓冲液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 压力下注入乙酰苯胺溶液 6 秒，然后将进样端和出样端的小瓶更换为 Tris 缓冲液小瓶。
      5. 施加 0.05 bar 压力 2.4 秒，以将毛细管尖端的乙酰苯胺溶液进一步推入内部。
      6. 施加 10.0 kV 电压 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液，重复步骤 2.2.1.1 至 2.2.1.6，并检测所有蛋白质峰。
   2. 准备含配体的测量方法。
      1. 用 0.1 M EDTA 溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      2. 用去离子水在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1 分钟。
      3. 用配体溶液在 2.5 bar 压力下冲洗毛细管 1.5 分钟以达到平衡。
      4. 在 0.05 bar 压力下注入乙酰苯胺溶液 6 秒，然后将进样端和出样端的小瓶更换为含配体的缓冲液小瓶。
      5. 施加 0.05 bar 压力 2.4 秒，以将毛细管尖端的乙酰苯胺溶液进一步推入内部。
      6. 施加 10.0 kV 电压 6 分钟，并在 200 nm 波长处检测乙酰苯胺峰。
      7. 使用蛋白质样品代替乙酰苯胺溶液，重复步骤 2.2.2.1 至 2.2.2.6，并检测所有蛋白质峰。
   3. 交替重复步骤 2.2.1 和 2.2.2，以计算不同蛋白质-金属离子相互作用下的电荷-尺寸比变化。
      1. 每 60 小时更换一次蛋白质溶液，使用新鲜溶液。
         注意： 此时实验可暂时暂停。由于每次运行的峰型略有差异，因此每种配体浓度至少需重复该过程 10 次。若溶液使用超过 60 小时，峰型变异将过大。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AtHIRD11 样品	静冈大学（M. Hara 教授课题组）		在大肠杆菌中表达的拟南芥脱水素蛋白
裸露熔融石英毛细管	Polymicro Technologies（美国凤凰城）	106815-0017	TSP050375，内径 50 μm，外径 363 μm，聚酰亚胺涂层
Agilent 1600A	Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆）		毛细管电泳仪；也可使用 Agilent 7100 CE
25 mL 洗耳球式移液管	Duran Group GmbH（德国美因茨）	24 338 14	配制配体溶液
25 mL Duran 玻璃容量瓶	Duran Group GmbH（德国美因茨）	24 671 1457	配制配体储备液
10 mL Duran 玻璃容量瓶	Duran Group GmbH（德国美因茨）	24 671 1054	配制配体储备液
乙酰苯胺	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	397229-5G	电渗流标记物
氯化锰(II)	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	13217	配体
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	431788-100G	冲洗液成分
氯化钡	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	202738-5G	配体
六水合氯化镍(II)	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	654507-5G	配体
四氯化硒	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	323527-10G	配体
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）	Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）	252859-100G	缓冲液成分
氯化锌(II)	Merck Millipore（德国达姆施塔特）	1088160250	配体
硝酸锶	Merck Millipore（德国达姆施塔特）	1078720250	配体
二水合氯化钙	Merck Millipore（德国达姆施塔特）	1371015000	配体
二水合氯化铜(II)	Riedel-de Haën（德国锡尔策）	31286	配体
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies（德国瓦尔德布隆）	G2070-91126	用于操作毛细管电泳仪器、采集数据并进行分析的软件包